تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

الهدف العام لنموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أو نموذج EAE هو تسهيل دراسة الآليات الجزيئية المحتملة الكامنة وراء تطور التصلب المتعدد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التصلب المتعدد مثل ، في أي مرحلة من مراحل المرض تتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج EAE يحاكي العديد من الخصائص الرئيسية للتصلب المتعدد ، مثل إزالة الميالين وتسلل الخلايا المناعية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج التصلب المتعدد لأن الأدوية التي تم اختبارها بهذه الطريقة قد تمت الموافقة عليها بالفعل لهذا المرض. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن هناك شروطا شاملة يجب أخذها في الاعتبار عند تحفيز EAE. يجب حفظ الفئران في بيئة خالية من الإجهاد ، ويجب تحضير سم السعال الديكي حديثا.

العرض الرسمي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم عزل الغدد الليمفاوية واستخراج الحبل الشوكي بالوصف وحده. ابدأ بحقن إناث الفئران البالغة من العمر 10 إلى 13 أسبوعا تحت الجلد ب 200 ميكروغرام من البروتين السكري قليل التغصن المايلين. مستحلب في 200 ميكرولتر من مساعد فرويند الكامل ، يحتوي على 400 ميكروغرام من المتفطرة السلية.

على الفور وبعد 24 ساعة ، قم بحقن الفئران داخل الصفاق ب 0.2 ميكروغرام من سم السعال الديكي في 200 ميكرولتر من PBS. من الضروري أن يتم تكييف الفئران مع كل من المناولة والبيئة التجريبية قبل تحريض EAE نحو إحداث الإجهاد الذي يمكن أن يمنع تطور الأعراض السريرية. بعد أسبوع واحد من الحقن ، افحص الفئران يوميا بحثا عن الأعراض السريرية كما هو موضح في الجدول.

لتقييم مجموعة الخلايا المناعية للعقدة الليمفاوية المستحثة في EAE ، في النقطة الزمنية المناسبة بعد الحث ، بلل منطقة الشق بنسبة 80٪ من الأيزوبروبانول ، وقم بإزالة الجلد بعناية فوق منطقة الورك. باستخدام الملقط ، قم بإزالة العقدة الليمفاوية الأربية بعناية من الأنسجة الدهنية. ثم قم بوزن العقدة ، وضع العينة في PBS على الجليد.

لتحليل خلايا الحبل الشوكي ، بلل ظهر بالأيزوبروبانول ، واستخدم مشرطا لعمل قطع طولي للعمود الفقري. ثم قم بإزالة الجلد وتشريح الجزء القطني من العمود الفقري ، مما يؤدي إلى تعصيب الأطراف الخلفية. اغسل العمود الفقري بحقنة مملوءة ب PBS لاستخراج الحبل الشوكي.

بعد إزالة ما يقرب من 1/3 من الحبل القطني ، قم بوزن جزء العمود الفقري ، وقم بتخزين الأنسجة في PBS على الجليد. لتحليل خلايا المناعة الطحالية ، افتح الأنسجة للوصول إلى الجزء السفلي من البطن. بعد ذلك ، قم بإزالة الطحال ، وقطع ما يقرب من 1/8 من الأنسجة.

قم بوزن جزء الطحال ، وقم بتخزين الأنسجة في PBS على الجليد. ثم استخدم المكبس من حقنة بحجم مللي لنقع باقي الأنسجة من خلال منخل شبكي 70 ميكرون على أنبوب سعة 50 مليلتر ، متبوعا بغسل PBS بسعة خمسة ملليلتر من المصفاة. الطرد المركزي الخلايا المفلترة.

أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية, ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا مرتين في 500 ميكرولتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 0.2٪ BSA في PBS ، وأضف ميكرولترين من مستقبلات Fc واحدة تمنع المخزن المؤقت للخلايا.

بعد 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، قم بتسمية الخلايا ب 13 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين على الأقل في 500 ميكرولتر من PBS ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 500 ميكرولتر من PBS الطازج. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي على الجليد.

أخيرا ، لتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مباشرة قبل قياس التدفق الخلوي ، أضف 30 ميكرولترا من معيار العد المطلق لقياس التدفق الخلوي إلى الخلايا لتحديد عدد الخلايا المطلق. ثم قم بتحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي. كما يوضح هذا الشكل ، لوحظت زيادة عابرة في جميع مجموعات الخلايا المناعية داخل الغدد الليمفاوية خلال المرحلة الحادة من تحريض EAE.

ومع ذلك ، في الطحال ، تظهر البلاعم والخلايا البائية والخلايا التائية والعدلات فقط تسلل متزايد. في الدم ، تظهر جميع مجموعات الخلايا المناعية زيادة عابرة في الدورة الدموية المحيطية خلال المرحلة ما قبل السريرية التي تتوافق مع زيادة مماثلة تعتمد على المرض في الحبل الشوكي القطني خلال المرحلة الحادة من المرض ، باستثناء مجموعة الخلايا الوحيدة ، والتي من المفترض أن تتمايز إلى البلاعم بعد الدخول إلى الحبل الشوكي. هنا ، يتم عرض استراتيجية البوابات لتقييم مجموعات الخلايا المختلفة.

ترتبط أعداد الخلايا بكمية الأنسجة أو حجم الدم الذي تم تحليله ، مما يعكس عدد الخلايا المطلق. في الغدد الليمفاوية ، يزداد تعبير IL-23 mRNA خلال المرحلة قبل السريرية ، بينما يزداد التعبير عن IL-6 بطريقة تعتمد على المرض. في الطحال ، يزداد تعبير IL-6 و IL-23 في المرحلة ما قبل السريرية ، في حين أن تعبير IL-1 beta mRNA لا يتأثر حتى ظهور المرض.

في الدم ، يتم تنظيم التعبير عن TNF-alpha mRNA فقط وبطريقة تعتمد على المرض. في الحبل الشوكي القطني ، يتم تحفيز TNF-alpha و IL-1 beta و interferon gamma خلال المرحلة الحادة ، بينما يتم تنظيم IL-6 خلال مرحلة ظهور المرض فقط. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال نموذج EAE وعزل الخلايا اللاحق وتحليل التأثيرات في ثماني ساعات لعشرة فئران إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Western Blot أو ELISA لتأكيد نتائج تحليل تعبير mRNA. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصلب المتعدد لاستكشاف آلية إزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز نموذج EAE وكيفية عزل الخلايا المناعية للحصول على نتائج قياس التدفق الخلوي القابلة للتكرار.

لا تنس أن العمل مع مساعد فرويند الكامل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب اتخاذ احتياطات إضافية مثل رفع جلد الفأر وضمان اختراق الجلد الكامل بواسطة المحقنة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.