تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

الهدف العام من نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE)، هو تسهيل دراسة الآليات الجزيئية المحتملة التي تكمن وراء تطور مرض التصلب المتعدد. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التصلب المتعدد، مثل: في أي مرحلة من مراحل المرض تخترق الخلايا المناعية الجهاز العصبي المركزي؟ تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن نموذج EAE يحاكي العديد من الخصائص الأساسية للتصلب المتعدد، مثل زوال الميالين وتسلل الخلايا المناعية.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج التصلب المتعدد لأن الأدوية التي تم اختبارها بهذه الطريقة قد تمت الموافقة عليها بالفعل لهذا المرض. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن هناك شروطاً دقيقة يجب مراعاتها عند تحفيز EAE. يجب إبقاء الفئران في بيئة خالية من الإجهاد، كما ينبغي تحضير ذيفان السعال الديكي (pertussis toxin) بشكل طازج.

يُعد العرض التوضيحي الرسمي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم كيفية عزل العقد اللمفاوية واستخراج النخاع الشوكي من خلال الوصف وحده. ابدأ بحقن إناث الفئران التي تتراوح أعمارها بين 10 إلى 13 أسبوعاً تحت الجلد بـ 200 micrograms من بروتين myelin oligodendrocyte glycoprotein، مستحلباً في 200 microliters من complete Freund's adjuvant الذي يحتوي على 400 micrograms من mycobacterium tuberculosis.

قم بحقن الفئران في التجويف البريتوني بـ 0.2 micrograms من سم السعال الديكي (pertussis toxin) في 200 microliters من PBS فوراً ثم بعد 24 ساعة. من الضروري أن تكون الفئران قد تكيفت مع المناولة والبيئة التجريبية قبل تحريض مرض EAE لتجنب إحداث إجهاد قد يمنع ظهور الأعراض السريرية. وبعد أسبوع من الحقن، افحص الفئران يومياً للبحث عن الأعراض السريرية كما هو موضح في الجدول.

لتقييم مجتمع الخلايا المناعية في العقد الليمفاوية المستحثة بواسطة EAE، وفي النقطة الزمنية المناسبة بعد الاستحثاث، يتم ترطيب منطقة الشق باستخدام isopropanol بتركيز 80%، وإزالة الجلد بعناية من منطقة الورك. باستخدام الملقط، تُزال العقدة الليمفاوية الأربية بعناية من النسيج الدهني. بعد ذلك، يتم وزن العقدة، ووضع العينة في PBS على الثلج.

لتحليل خلايا النخاع الشوكي، بلل ظهر الحيوان باستخدام الكحول الإيزوبروبيلي، واستخدم مشرطاً لإجراء قطع طولي على طول العمود الفقري. بعد ذلك، قم بإزالة الجلد وتشريح الجزء القطني من العمود الفقري الذي يغذي الأطراف الخلفية بالأعصاب. ثم اغسل العمود الفقري باستخدام سرنجة مملوءة بمحلول PBS لاستخراج النخاع الشوكي.

بعد إزالة ما يقرب من 1/3 من الحبل القطني، قم بوزن قطعة النخاع الشوكي، واحفظ النسيج في PBS على الثلج. ولتحليل مجموعة الخلايا المناعية الطحالية، افتح النسيج للوصول إلى الجزء السفلي من البطن. بعد ذلك، قم بإزالة الطحال، واقطع ما يقرب من 1/8 من النسيج.

قم بوزن قطعة الطحال، واحفظ النسيج في محلول PBS على الثلج. بعد ذلك، استخدم مكبس حقنة سعة 2 mL لسحق بقية النسيج عبر مصفاة شبكية بمسام 70 micron فوق أنبوب سعة 50 milliliter، ثم اغسل المصفاة بـ 5 milliliter من محلول PBS. قم بطرد الخلايا المُرشحة مركزياً.

أعد تعليق الراسب في 500 µL من منظم تحلل الخلايا، وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 mL. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، اغسل الخلايا مرتين في 500 µL من PBS. بعد الغسلة الثانية، أعد تعليق الراسب في 100 µL من 0.2% BSA في PBS، وأضف 2 µL من منظم حجب مستقبل Fc إلى الخلايا.

بعد مرور 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة، قم بوسم الخلايا باستخدام 13 µL من مزيج الأجسام المضادة لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وفي نهاية فترة التحضين، اغسل الخلايا مرتين على الأقل في 500 µL من PBS، ثم أعد تعليق الراسب النهائي في 500 µL من PBS طازج. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي على الثلج.

أخيرًا، لتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي، وقبل إجراء القياس مباشرةً، أضف 30 µL من معيار العد المطلق لقياس التدفق الخلوي إلى الخلايا لتحديد أعداد الخلايا المطلقة. ثم قم بتحليل العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. وكما يوضح هذا الشكل، لوحظت زيادة عابرة في جميع مجموعات الخلايا المناعية داخل العقد اللمفاوية خلال المرحلة الحادة من تحفيز EAE.

أما في الطحال، فإن الخلايا البلعمية، والخلايا البائية، والخلايا التائية، والعدلات فقط هي التي تظهر زيادة في الارتشاح. وفي الدم، تظهر جميع مجموعات الخلايا المناعية زيادة مؤقتة في دورتها الطرفية خلال المرحلة قبل السريرية، وهو ما يتوافق مع زيادة مماثلة تعتمد على المرض في الحبل الشوكي القطني خلال المرحلة الحادة من المرض، باستثناء مجموعة الخلايا الوحيدة، والتي يُفترض أنها تتمايز إلى خلايا بلعمية بعد دخولها إلى الحبل الشوكي. وتظهر هنا استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) لتقييم مجموعات الخلايا المختلفة.

ترتبط أعداد الخلايا بكمية النسيج أو حجم الدم الذي تم تحليله، مما يعكس العدد المطلق للخلايا. وفي العقد اللمفاوية، يزداد تعبير mRNA لـ IL-23 خلال المرحلة قبل السريرية، بينما يزداد تعبير IL-6 بطريقة تعتمد على المرض. أما في الطحال، فيزداد تعبير IL-6 وIL-23 في المرحلة قبل السريرية، في حين لا يتأثر تعبير mRNA لـ IL-1 beta حتى بداية المرض.

في الدم، يرتفع تعبير mRNA الخاص بـ TNF-alpha فقط وبطريقة تعتمد على المرض. أما في النخاع الشوكي القطني، فيتم تحفيز TNF-alpha و IL-1 beta و interferon gamma خلال المرحلة الحادة، بينما يرتفع تعبير IL-6 خلال مرحلة بداية المرض فقط. وبمجرد إتقان نموذج EAE، يمكن إتمام عمليات عزل الخلايا اللاحقة وتحليل التأثيرات في غضون ثماني ساعات لعشرة فئران إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Western Blot أو ELISA لتأكيد نتائج تحليل تعبير mRNA. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال التصلب المتعدد لاستكشاف آلية إزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز نموذج EAE وكيفية عزل الخلايا المناعية للحصول على نتائج تدفق خلوي قابلة للتكرار.

لا تنسَ أن العمل باستخدام مساعد فروند الكامل (complete Freund's adjuvant) يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ احتياطات مثل رفع جلد الفأر والتأكد من اختراق السرنجة للجلد تماماً أثناء تنفيذ هذا الإجراء.