الأمثل والاستفادة من

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير طريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتوسع للإنتاج المؤقت للبروتينات المؤشبة في نظام قائم على النباتات باستخدام تقنية التسلل بواسطة الأجروبكتيريوم. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحسين ظروف نمو النبات. وتتمثل الخطوة الثانية في تحويل الأجروبكتيريوم باستخدام نواقل الإطلاق التي تجمع بين مكونات الفيروسات النباتية والبلازميدات الثنائية، يتبع ذلك زراعة الأجروبكتيريوم المتحول لاستخدامه في تجارب التسلل.

خلال عملية الترشيح باستخدام بكتيريا الأجروبكتيريوم (Agrobacterium)، يتم قلب النباتات رأساً على عقب وغمر الأجزاء الهوائية في معلق من بكتيريا الأجروبكتيريوم. ثم يتم تطبيق تفريغ هوائي، مما يؤدي إلى إخلاء الهواء من الفراغات البينية في أنسجة الأوراق. ويؤدي إعادة الضغط السريع بعد تحرير التفريغ إلى تدفق معلق بكتيريا الأجروبكتيريوم إلى داخل الأوراق.

في نهاية المطاف، تُستخدم تقنيات اللطخة المناعية ومقايسات الفلورة لإظهار إنتاج البروتين المؤتلف في النباتات التي خضعت للترشيح. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الترشيح اليدوي، في إمكانية توسيع نطاق طريقة الترشيح بالتفريغ لإنتاج البروتينات المؤتلفة صناعياً، بما في ذلك اللقاحات والبروتينات العلاجية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية، وتسهيل استخدام النباتات كمنصة بديلة للإنتاج التجاري للبروتينات المؤتلفة.

جاءت فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما اكتشفنا أن توسيع نطاق الترشيح الزراعي للنباتات المزروعة في التربة يمثل تحدياً. وذلك لعدة أسباب، حيث تحتوي التربة على ملوثات مثل الفيروسات والبكتيريا والنيماتودا، بالإضافة إلى أن محتوى التربة ومياه الري يختلفان من دفعة إلى أخرى ومن موسم إلى آخر، كما أن التربة تتكتل بمرور الوقت أثناء التخزين. علاوة على ذلك، فإن قلب النباتات المزروعة في التربة من شأنه أن يؤدي إلى تساقط التربة بشكل غير مرغوب فيه داخل مستنبت الـ agrobacterium أثناء عملية الترشيح.

ستقوم بتوضيح هذا الإجراء ريبيكا سنو، وهي مساعد بحث أول من مختبر بيولوجيا النبات والهندسة، وإيما غوت روبن لوب، وهي وآدام تريفور مساعدا بحث من مختبري. تستخدم هذه الدراسة وسط نمو نباتي مائي ومحلولاً مغذياً لضمان توحيد نمو النباتات ولإزالة التعقيدات المرتبطة باستخدام التربة في زراعة النباتات.

لبدء هذا الإجراء، انقع ألواح الصوف الصخري في محلول سماد نباتي لمدة خمس دقائق، ثم ازرع البذور يدويًا على سطح الصوف الصخري المنقوع في المغذيات. سيتم في هذه الدراسة تقييم ثلاثة أنواع من Cedar Nico Oceana، وهي نوعان بريان: Nico Oceana وBenham Ana وNico Oceana Excelsior، وهجين من Benham وAna وExcelsior يسمى Nico Oceana Excela. تُزرع النباتات من البذور تحت ظروف محكومة وفترة ضوئية نهارية طويلة في نظام زراعة مائية متتالي.

تُزرع أصناف Nico Oceana و Bentham Miana و Nico Oceana Excela لمدة تتراوح بين أربعة إلى خمسة أسابيع، وصنف Nico Oceana Excelsior لمدة تتراوح بين خمسة إلى ستة أسابيع. وقد تم تحويل سلالات Agrobacterium tumor Fasion المستخدمة في هذه التجربة باستخدام ناقلات الإطلاق المناسبة كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. ولأغراض هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام خمس سلالات من agrobacterium المحولة.

يتم استزراع سلالات Agrobacterium GV 3 1 0 1 التي تحمل جين البروتين الفلوري الأخضر المراسِل GFP، أو سلالات GV 3 1 0 1 التي تحمل الجين الفيروسي لكابت الإسكات P 19 الخاص بفيروس التبرعم المتقزم للطماطم، أو سلالات GV 3 1 0 1 التي تحمل جين بروتين ناقل معدل لإنزيم الليياز Lick KM، طوال الليل في وسط LB مضاف إليه 50 mg/L من الكانامايسين عند درجة حرارة 28 °C مع الرج بسرعة 200 إلى 250 RPM. وفي اليوم التالي، يتم تحضير معلقات Agrobacterium للتجارب المطلوبة؛ ولفحص جدوى استخدام سلالات Agrobacterium متعددة للإنتاج المؤقت للبروتين، يتم تخفيف سلالة مختبرية وسلالتين من النوع البري، والتي تحمل ناقل PBI four lick km، في مياه milli Q حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nm إلى 0.5.

لبحث ضرورة تحفيز جينات الضراوة في بكتيريا agrobacterium قبل عملية الترشيح، يتم أولاً طرد مركزي لمزارع agrobacterium التي تحمل ناقل P bid 4G FP والمنمّاة في وسط LB بسرعة 4,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. ثم تُعاد المعلق في وسط تحفيز MMA حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.5، وتُقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. لاختبار ما إذا كان الأسيتيل كون يعزز إنتاج البروتين العابر، يتم إجراء طرد مركزي لمزرعة agrobacterium التي تحمل ناقل PBI 4G FP والمنمّاة طوال الليل في وسط LB، ثم تُعاد المعلق في محلول ترشيح منظم يحتوي على 1X ms salt و 10 millimolar MES و 2% glucose.

قسّم معلق الخلايا إلى أربعة أوعية. أضف تركيزاً مختلفاً من aceto cone إلى كل معلق من agrobacterium ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. لاختبار تأثير التسريب المشترك لمثبط إسكات فيروسي على الإنتاج المؤقت لبروتين GFP، قم بالخلط.

مزيج من مستنبت بكتيريا agrobacterium المخصب بجين GFP ومستنبت يحمل مثبط الإسكات الفيروسي P 19، والمنقى بماء milli Q، بنسبة أربعة إلى واحد، وذلك أثناء عملية الرش بالتخلخل (vacuum infiltration) للنباتات، والتي سيتم عرضها. من الضروري بعد ذلك التحكم في ضغط التخلخل ومدة عملية الرش لتخلخل النباتات. أولاً، انقل معلق agrobacterium المُحضّر إلى وعاء داخل غرفة التخلخل.

بعد ذلك، اقلب النبات رأساً على عقب في مستنبت الأجروبكتيريوم (agrobacterium) المخفف، وقم بتطبيق تفريغ هوائي يتراوح بين 50 إلى 400 millibar لمدة 30 أو 60 ثانية. وعادةً ما يتم تطبيق الترشيح الأمثل عند 50 إلى 100 millibar لمدة 60 ثانية. وبمجرد كسر التفريغ، أخرج النباتات من غرفة التفريغ، واغسلها بالماء، واتركها تنمو لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام تحت نفس ظروف النمو المستخدمة في مرحلة النمو قبل الترشيح.

لتحضير العينات لتحليل Western، ابدأ أولاً بجمع عينات عشوائية من أوراق نباتات Nico Oceana، أو Benham Miana، أو Nico Oceana Excelsior، أو Nico Oceana Excela بعد مرور أربعة إلى سبعة أيام من عملية التسلل أو DPI، ثم قم بسحق عينات الأوراق في النيتروجين السائل حتى تتحول إلى مسحوق ناعم. أضف ثلاثة أحجام من محلول XPBS المنظم الذي يحتوي على 0.5%Triton X 100 إلى كل عينة، وانقل العينة إلى أنبوب einor. قم برج أو تدوير العينات المستخلصة بلطف لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

قم بطرد المستخلص مركزياً لمدة خمس دقائق واجمع البروتين الذائب الكلي في أنبوب إينور نظيف. خفف المستخلصات إلى التخفيف المناسب في محلول استخلاص 1X PBS، وأضف محلول عينات 5x ليصل إلى تركيز نهائي 1X. قم بغلي العينات لمدة خمس دقائق قبل فصل البروتينات بواسطة SDS page.

بعد نقل البروتينات إلى غشاء نقل P ثابت، يتم الكشف عن GFP باستخدام مصل مضاد لـ GFP متعدد النسائل من الأرانب بتخفيف 1 إلى 5,000 في محلول الحجب. تُحضن الأغشية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع الرج اللطيف بعد غسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام 1 X-P-B-S-T 20. ثم تُحضن مع جسم مضاد مضاد للأرانب مقترن ببيروكسيداز الفجل في تخفيف 1 إلى 5,000 لمدة ساعة واحدة للكشف عن GFP.

بعد ذلك، يتم معالجة لطخات ويسترن (western blots) وتحليل شدة النطاقات المقابلة للبروتينات كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. يتم الكشف المرئي عن فلورة GFP في النباتات الكاملة التي خضعت للتحول العابر باستخدام مصباح UV محمول ذو طول موجي طويل، مع استخدام كاميرا رقمية وزمن تعريض قدره 15 ثانية لتصوير النباتات المحولة عابراً من خلال مرشح أصفر eight ES 52. يتم الحصول على الصور من تحليلات لطخات ويسترن باستخدام برنامج gene snapped على جهاز genome.

قم بقياس النتائج كمياً باستخدام برنامج gene tool مع منحنى معايرة يعتمد على معيار GFP منقى؛ حيث تمت زراعة Nick Oceana Bentham Miana على ألواح Rockwell مغمورة في أسمدة متوفرة تجارياً لتحديد الظروف المثلى لنمو النبات وتراكم الكتلة الحيوية. يعد وجود الفوسفور أمراً بالغ الأهمية لتحقيق إنبات ونمو بذور NICO Oceana. Bentham، كما يظهر في هذه النباتات التي يبلغ عمرها ستة أسابيع وتنمو إما في محلول سمادي يحتوي على 4.8% phosphorus أو محلول سمادي يحتوي على 0% phosphorus.

تم فحص تأثيرات أوساط نمو وتسلل بكتيريا Agrobacterium على صحة النبات وإنتاج البروتين من خلال مقارنة إنتاج GFP في نباتات Nicotiana hamana التي تم تسللها بالتفريغ الهوائي باستخدام مزارع Agrobacterium حاملة لـ PBI 4G FP والمنماة في ثلاثة أوساط مختلفة. تم طرد مزارع YEB وAB وLB المنماة طوال الليل في أوساط YEB أو LB مركزياً بسرعة منخفضة ثم إعادة تعليقها في وسط تحريض MMA، أو نمت طوال الليل في أوساط YEB أو LB أو AB وخففت مباشرة بنسبة 1 إلى 5 أو 1 إلى 10 باستخدام ماء Milli Q. وكما هو موضح في نتيجة تحليل Western blot هذه، لم تظهر النباتات التي تم تسللها بمزارع Agrobacterium المنماة في أوساط YEB أو LB أو AB والمخففة بماء Milli Q أي اختلاف ملحوظ في متوسط إنتاج GFP مقارنة بالمزارع التي طردت مركزياً وأعيد تعليقها في وسط MMA.

وبناءً على ذلك، يوصى باستخدام مياه milli Q لتخفيف مستنبتات agrobacterium المخصصة للترشيح النباتي، وقد استُخدمت بشكل روتيني في التجارب اللاحقة للوصول إلى كثافة ضوئية عند 600 نانومتر تبلغ 0.5. بعد ذلك، تم فحص تأثيرات كثافة معلق خلايا agrobacterium والتسلسل الزمني على التعبير المستهدف. تم تقييم أربع كثافات مختلفة لمعلق خلايا agrobacterium الحاملة لـ PBI 4G FP، وجُمعت عينات الأوراق بعد أربعة وسبعة و10 أيام من الترشيح (DPI) لتحليل western blot. عند اليوم الرابع من الترشيح (4 DPI)، ظهرت اختلافات ملحوظة في فلورة GFP بين النباتات التي تم ترشيحها بكثافات مختلفة من معلق خلايا agrobacterium، ولم يُلاحظ أي تعبير لـ GFP عند كثافة 600 تبلغ 0.05 في اليوم السابع من الترشيح (7 DPI).

كان الفلورة متشابهة في النباتات التي تم حقنها بمعلقات خلوية بكثافات 601.0 و0.5 و0.1، ولكنها كانت أقل في النباتات التي تم حقنها عند A 600 بقيمة 0.05، وذلك على النقيض في اليوم العاشر بعد الحقن (10 DPI). ولم تُلاحظ أي فروق في إنتاج GFP بين النباتات التي تم حقنها بأي من كثافات المعلق الخلوي الأربع لزيادة تنوع سلالات agrobacterium المتاحة لإنتاج البروتين العابر.

تم إجراء ترشيح تفريغي لنباتات Nicotiana Benham miana باستخدام سبع سلالات مختلفة من بكتيريا agro bacteria التي تحمل الناقل KBI four lick km. جُمعت الأوراق المرشحة بعد سبعة أيام من التلقيح (DPI)، وقُدر مستوى تعبير kinase عن طريق تقنية Western blot. وكما يظهر في هذا الرسم البياني، تم تحقيق أعلى مستوى من إنتاج liase باستخدام السلالات GV 3 1 10 و1 A four وLBA 4 4 0 4 مع وجود اختلافات طفيفة.

بينما كان أدنى مستوى للتعبير مرتبطاً بـ C five eight C one، فقد تم تحقيق إنتاج متوسط لإنزيم اللييز باستخدام السلالات a T 77 وA T zero six وa T 10. وقد تم إثبات النشاط الإنزيمي للييز باستخدام مقايسة a XMO Graham. واستُخدم بروتين اللييز البكتيري المنقى كضابط موجب لنشاط الإنزيم. ومن المثير للاهتمام أن نباتات nicotiana Benham miana التي تم تلقيحها بسلالات agrobacterium من النوع البري A four وa T seven seven أظهرت أعراضاً مرضية مثل التقزم، واستطالة السويقة، وتجعد الأوراق في اليوم السابع بعد التلقيح (7 DPI).

كانت الأعراض خفيفة في نباتات nicotiana benham التي حُقنت بالنمط البري من سلالة T 10. ولم تُلاحظ أي أعراض في نباتات Nico Oceana Benham التي حُقنت بالسلالة المختبرية GV 3 1 0 1. وأظهرت مقارنة لإنتاج الكتلة الحيوية النباتية في أنواع النمط البري أنه تحت ظروف النمو نفسها، فإن أعلى كتلة حيوية للأوراق يمكن إنتاجها من Nico Oceana Excela تزيد بنحو ضعفين مقارنة بـ Nico Oceana.

تم فحص إنتاج بروتين Benham في أصناف Nico Oceana Benham وNico Oceana Excelsior وNico Oceana Excela التي تم تلقيحها بسلالة agrobacterium GV 3 1 0 1 التي تحمل PBI 4G F-P-G-F-P، حيث تم تقييم تراكم GFP بعد سبعة أيام من التلقيح (DPI) في الأوراق الملقحة بالكامل. أظهر الفحص البصري للتعبير عن GFP تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) توزيعاً متساوياً لـ GFP في Nico Oceana Hamana وNico Oceana Excela، وتوزيعاً غير متساوٍ في Nico Oceana Excelsior بسبب صعوبة تلقيح كامل مساحة الورقة في Nico Oceana Excelsior. وأظهر تحليل Western blot لتراكم GFP في هذه الأوراق الملقحة بعد سبعة DPI أن مستوى GFP كان أعلى في Nico Oceana Hamana مقارنة بـ Nico Oceana Excela وNico Oceana Excelsior، مما يشير إلى انخفاض مستوى إنتاج البروتين في Nico Oceana.

يعود السبب في ظهور التفاوت إلى عدم انتظام الترشيح والتوزيع غير المتكافئ لبروتين GFP المتراكم في الورقة المجمعة. ولاختبار تأثير ضغط الفراغ على الأوراق، تم ترشيح نباتات Nico Oceana Benham باستخدام سلالة agrobacterium وهي GV 3 1 0 1 التي تحمل PBI 4G FP تحت ضغوط فراغ بلغت 400 أو 200 أو 100 أو 50 millibar مع مدة تثبيت للفراغ بلغت 30 أو 60 ثانية. ولم تُلاحظ أي اختلافات في إنتاج GFP، كما لوحظ تأثير ضئيل أو عدم وجود تأثير ضار على صحة النبات عند تطبيق ضغوط فراغ بلغت 5 و100 و200 millibar لمدة 30 أو 60 ثانية.

تم تقييم تأثير مدة الفراغ على تعبير الهدف من خلال حقن مسطح واحد من نباتات Nico Oceana Benham كل ساعة باستخدام A 600 بقيمة 0.5 من GV 3 1 0 1 التي تحمل PBI 4G FP لمدة ثماني ساعات. وفي نفس مزرعة الأجروبكتيريوم الموضحة في هذه النتيجة الممثلة، كان مستوى إنتاج GFP متشابهًا في جميع النقاط الزمنية حتى ثماني ساعات، مما يشير إلى أن الأجروبكتيريوم يحافظ على قدرته على إطلاق DNA مفرد السلسلة خلال هذه الفترة الزمنية. نظرًا لأنه تم الإبلاغ عن قدرة العديد من المواد الكيميائية والسكريات الأحادية على تعزيز إنتاج البروتين العابر في أنواع نباتية مختلفة.

قيمت هذه الدراسة أيضاً تأثير تركيزات مختلفة من acetosyringone والجلوكوز على الإنتاج العابر لبروتين GFP في نبات Nicotiana oceana بنهام، التي تم حقنها بسلالة agrobacterium GV 3 1 0 1 التي تحمل PBI 4G FP. تم تنمية بكتيريا agrobacterium طوال الليل في وسط YEB، ثم تم إجراء طرد مركزي لها وإعادة تعليقها لتصل قيمة a 600 إلى 0.5، إما في وسط MMA يحتوي على 2% glucose مع acetyl syringone بالتركيزات المحددة، أو في وسط MMA يحتوي على 200 micromolar acetophenone مع glucose بالتركيزات المحددة. وكما هو موضح هنا، لم يؤدِ أي من التركيزات المختبرة لهذه المركبات إلى زيادة ملحوظة في إنتاج بروتين GFP مقارنة بالمجموعة الضابطة حيث لم يحتوي وسط الحث على acetophenone أو glucose.

بعد ذلك، تم فحص تأثير التسلل المشترك لمثبط إسكات على التعبير العابر لجينات GFP وHAC one في أوراق Nicotiana benham. وقبل التسلل، خُلطت مستنبتات Agrobacterium GV3101 التي تحمل PBI 4G FP ومثبط الإسكات الفيروسي P19 الخاص بـ tomato bushy stunt virus بنسب 1:1، و2:1، و3:1، و4:1 على التوالي. وكما أشارت نتائج تحليل Western blot عند 7 DPI، فإن وجود P19 لم يؤدِ إلى زيادة أو نقصان في إنتاج GFP في Nicotiana benham عند أي نسبة من معلقات Agrobacterium.

بالإضافة إلى ذلك، تم استقصاء تأثير اثنين من مثبطات إسكات الجينات الفيروسية P 23 و P 19 على منع إسكات الجينات بعد النسخي لـ HAC one. تم خلط مستنبتات agrobacterium الحاملة لناقل الإطلاق PBI four HAC one، وأحد البلازميدين المثبطين للإسكات الفيروسي بنسبة أربعة إلى واحد على التوالي، ثم تم حقنهما معاً في نبات Nicotiana Bentham Miana. جُمعت عينات الأوراق المحقونة في الفترة من 3 إلى 8 أيام بعد الحقن (DPI).

يوضح هذا الرسم البياني متوسط مستويات تعبير HAC one من ثلاث تجارب كما تم تحديدها بواسطة تحليل Western blot. أدى التسلل المشترك لـ Nico Oceana Benham مع P 23 أو P 19 إلى زيادة في إنتاج HAC one مقارنةً بعدم استخدام كابت للإسكات عند 60 pi. يشير هذا إلى أن P 23 و P 19 فعالان في هذا النظام.

لوحظ أيضاً أنه في حال وجود أو غياب مثبط لإسكات الجينات، بدأ مستوى إنتاج بروتين HAC one في الانخفاض عند اليوم السابع بعد التلقيح (7 DPI). يشير هذا إلى أن توقيت انخفاض إنتاج البروتين العابر في نبات Nico Oceana Benham Miana الذي تم تلقيحه بناقل الإطلاق هو أمر خاص بالهدف. وأخيراً، يتم تقييم استقرار بنك خلايا Agrobacterium سنوياً عن طريق تلقيح نباتات nicotiana benham بنفس الدفعة من بنك خلايا Agrobacterium لتقييم تراكم البروتين.

تشير هذه النتائج التمثيلية إلى أن إنتاج بروتين HA one كان مستقراً للغاية لأكثر من ثلاث سنوات. ويبلغ متوسط إنتاج HAC one في نباتات Nicotiana benam حوالي 651 plus or minus 49.4 milligrams per kilogram. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق تقنية الارتشاح الزراعي (agro infiltration) لإنتاج البروتينات المؤتلفة على نطاق واسع، والتي يمكن استخدامها في تصنيع اللقاحات الفرعية، والأجسام المضادة للبروتينات، والمستضدات التشخيصية.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحكم في تهجين النباتات مائيًا، واستخدام بكتيريا agro حيوية، والتحكم في ضغط التفريغ والترشيح، ومراقبة ناقل التعبير البروتيني. وبمجرد إتقان تقنية ترشيح agro، يمكن إتمامها في غضون 24 hour إذا تم تنفيذها بشكل صحيح تحت ظروف خاضعة للرقابة.