الأمثل والاستفادة من الأجرعية بوساطة إنتاج بروتين عابر في نيكوتيانا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير طريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتطوير لإنتاج البروتين المؤتلف العابر في نظام نباتي باستخدام تقنية التسلل الزراعي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحسين ظروف نمو النبات أولا. الخطوة الثانية هي تحويل البكتيريا الزراعية بنواقل الإطلاق التي تجمع بين مكونات الفيروسات النباتية والبلازميدات الثنائية ، تليها زراعة البكتيريا الزراعية المحولة لاستخدامها في التجارب الزراعية.

أثناء تسلل البكتيريا الزراعية ، تنقلب النباتات رأسا على عقب وتغمر الأجزاء الهوائية في معلق البكتيريا الزراعية. ثم يتم تطبيق فراغ مما يتسبب في إخلاء الهواء من الفراغات بين الخلايا في أنسجة الأوراق. من خلال إعادة الضغط السريع بعد إطلاق الفراغ يؤدي إلى ضخ معلق البكتيريا الزراعية في الأوراق.

في النهاية ، يتم استخدام فحوصات النشاف المناعي والفلورة لإظهار إنتاج البروتين المؤتلف في النباتات المتسللة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التسلل اليدوي ، هي أنه يمكن توسيع نطاق طريقة التسلل الفراغي للإنتاج الصناعي للبروتينات المؤتلفة ، بما في ذلك اللقاحات والبروتينات العلاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التكنولوجيا الحيوية النباتية ، وتسهيل استخدام النباتات كمنصة بديلة لإنتاج البروتين المؤتلف التجاري.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما اكتشفنا أن توسيع نطاق الترشيح الزراعي في نباتات زراعة التربة يمثل تحديا. لعدة أسباب ، تحتوي التربة على أوتشين مثل الفيروسات والبكتيريا والديدان الخيطية ، بالإضافة إلى ذلك ، يختلف محتوى التربة ومياه الري من دفعة إلى أخرى ومن موسم إلى آخر ، وبيض التربة بمرور الوقت في التخزين. علاوة على ذلك ، فإن تقليب نباتات زراعة التربة قد يؤدي إلى تقطير غير مرغوب فيه للتربة في زراعة البكتيريا الزراعية أثناء التسلل.

ستظهر هذا الإجراء ريبيكا سنو ، مساعدة باحثة أولى من بيولوجيا النبات والمختبر الهندسي ، وإيما جوت روبن لوب. هي هي وآدم تريفور ، وهما مساعد باحث من مختبري. تستخدم هذه الدراسة وسط نمو النبات المائي ومحلول المغذيات لضمان توحيد نمو النبات والقضاء على التعقيدات المرتبطة باستخدام التربة لزراعة النباتات.

لبدء هذا الإجراء ، انقع ألواح الصوف الصخري في محلول سماد نباتي لمدة خمس دقائق ، وزرع البذور يدويا على سطح الصوف الصخري المنقوع بالمغذيات. باستخدام الأرز ، سيتم تقييم ثلاثة أنواع من نيكو أوشيانا في هذه الدراسة ، نوعان من النوع البري ، نيكو أوشيانا ، وبنهام آنا ، ونيكو أوشيانا إكسلسيور ، وهجين من بنهام وآنا وإكسلسيور يدعى نيكو أوشينا. تنمو نباتات Excela من البذور في ظل ظروف خاضعة للرقابة وتنمو فترة تصوير يوم طويل في نظام متتالي مائي.

نيكو أوشيانا ، بنثام ميانا ، ونيكو أوشيانا إكسيلا لمدة أربعة إلى خمسة أسابيع ، ونيكو أوشيانا إكسلسيور لمدة خمسة إلى ستة أسابيع. تم تحويل سلالات Agrobacterium Tumor Fasion المستخدمة في هذه التجربة باستخدام نواقل الإطلاق المناسبة كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. لأغراض هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام خمس سلالات من البكتيريا الزراعية المحولة.

GV 3 1 0 1 ، يحمل بروتين فلورسنت أخضر مراسل ، أو جين GFP GV 3 1 0 1 ، يحمل الجين الفيروسي لقامع إسكات فيروس حيلة الطماطم الكثيفة P 19 و A أربعة GV 3 1 0 1 ، و T 10. تحمل جين البروتين الناقل المعدل أو لعق KM تنمو سلالات البكتيريا الزراعية بين عشية وضحاها في وسط LB ، مع استكمال 50 ملليغرام لكل لتر من علبة المايسين عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 إلى 250 دورة في الدقيقة في اليوم التالي. إعداد معلقات البكتيريا الزراعية للتجارب المرغوبة لفحص جدوى استخدام سلالات متعددة من البكتيريا الزراعية لإنتاج البروتين العابر ، وتخفيف سلالة معملية وسلالتين من النوع البري ، مع إيواء متجه PBI بطول أربعة كيلومترات في ماء مللي Q إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5.

التحقيق في ضرورة إحداث جينات ضراوة البكتيريا الزراعية قبل التسلل إلى مزارع البكتيريا الزراعية الأولى التي تحمل ناقل P bid 4G FP المزروع في وسط LB عند 4,000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإعادة التعليق في وسط الحث MMA إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5 وحركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين لاختبار ما إذا كان مخروط الأسيتيل يعزز إنتاج البروتين العابر ، أجهزة الطرد المركزي وثقافة البكتيريا الزراعية. يحمل ناقل PBI 4G FP الذي ينمو بين عشية وضحاها في وسط LB ويعاد تعليقه في مخزن مؤقت للتسلل يحتوي على ملح X ms 10 مللي مولار ، MES ، و 2٪ جلوكوز.

قسم تعليق الخلية إلى أربع حاويات. أضف تركيزا مختلفا من مخروط الأسيتو إلى كل من معلقات البكتيريا الزراعية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. لاختبار تأثير التسلل المشترك لمثبط إسكات الفيروس على مزيج إنتاج بروتين GFP العابر.

ثقافة البكتيريا الزراعية المخففة بالماء مللي Q تحمل جين GFP وثقافة تحمل مثبط إسكات الفيروس P 19 بنسبة أربعة إلى واحد أثناء التسلل الفراغي للنباتات ، والذي سيتم إثباته. التالي أمر بالغ الأهمية للتحكم في ضغط الفراغ ومدة التسلل إلى محطات التسلل بالفراغ. أولا ، انقل معلق البكتيريا الزراعية المحضر إلى وعاء داخل غرفة التفريغ.

ثم اقلب النبات رأسا على عقب في البكتيريا الزراعية المخففة وقم بتطبيق فراغ من 50 إلى 400 ملي بار لمدة 30 أو 60 ثانية. يتم تطبيق التسلل الأمثل بشكل روتيني عند 50 إلى 100 مللي بار لمدة 60 ثانية. بمجرد كسر الفراغ ، قم بإزالة النباتات من غرفة التفريغ ، واشطفها بالماء ، وتنمو لمدة خمسة إلى سبعة أيام في ظل نفس ظروف النمو المستخدمة لنمو ما قبل الترشيح.

لتحضير عينات للتحليل الغربي ، أولا ، قم بجمع عينات أوراق عشوائية من نباتات Nico Oceana أو Benham Miana أو Nico Oceana Excelsior أو Nico Oceana Excela في غضون أربعة إلى سبعة أيام بعد التسلل أو سحق DPI عينات الأوراق في النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم. أضف ثلاثة مجلدات من مخزن XPBS واحد يحتوي على 0.5٪ Triton X 100 إلى كل عينة ، وانقل العينة إلى أنبوب einor. رج العينات المستخرجة أو قم بتدويرها برفق لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بتدوير المستخلص لمدة خمس دقائق وجمع البروتين القابل للذوبان الكلي في أنبوب أينور نظيف. قم بتخفيف المستخلصات إلى تخفيف مناسب في مخزن مؤقت واحد لاستخراج XPBS ، وأضف خمسة × عينة عازلة إلى تركيز X النهائي. قم بغلي العينات لمدة خمس دقائق قبل فصل البروتينات بواسطة صفحة SDS.

بعد نقل البروتينات إلى غشاء نقل الفوسفور غير المتحرك واكتشاف GFP باستخدام مصل مضاد للأرانب متعدد النسيلة مضاد ل GFP عند تخفيف من واحد إلى 5 ، 000 في محلول منع. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع هزاز لطيف بعد غسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام X-P-B-S-T 20. احتضان مع الفجل الحصان بيروكسيداز الأجسام المضادة المضادة لداء إضافة تخفيف من واحد إلى 5,000 لمدة ساعة واحدة للكشف عن GFP.

بعد ذلك ، تتم معالجة البقع الغربية وتحليل شدة الشريط المقابلة للبروتينات كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. يتم الكشف البصري عن مضان GFP في النباتات المحولة بشكل عابر باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي المحمول باليد ، واستخدام كاميرا رقمية ووقت تعرض يبلغ 15 ثانية لتصوير النباتات المحولة بشكل عابر من خلال مرشح أصفر ثمانية ES 52. احصل على صور من تحليلات اللطخة الغربية باستخدام برنامج القطع الجيني على الجينوم.

قم بتحديد النتائج باستخدام برنامج أداة الجينات مع منحنى معايرة يعتمد على معيار GFP المنقى ، تمت زراعة Nick Oceana Bentham Miana على ألواح Rockwell المنقوعة في الأسمدة المتاحة تجاريا لتحديد الظروف المثلى لنمو النبات وتراكم الكتلة الحيوية. يعد وجود الفوسفور أمرا بالغ الأهمية لتحقيق إنبات ونمو NICO Oceana. بذور بنثام كما هو موضح في هذه النباتات التي يبلغ عمرها ستة أسابيع تنمو إما في محلول سماد يحتوي على 4.8٪ فوسفور أو محلول سماد يحتوي على 0٪ فوسفور.

تم فحص آثار نمو البكتيريا الزراعية ووسائط التسلل على صحة النبات وإنتاج البروتين من خلال مقارنة إنتاج GFP في نيكوتيانا. تتسلل نباتات الهامانا بالفراغ مع PBI 4G FP التي تؤوي مزارع البكتيريا الزراعية المزروعة في ثلاث وسائط مختلفة. تم طرد مزارع YEB AB و LB المزروعة بين عشية وضحاها في وسائط YEB أو LB بسرعة منخفضة وإعادة تعليقها في وسط حث MMA أو نمت بين عشية وضحاها في وسائط YEB LB أو AB وتخفيفها مباشرة من واحد إلى خمسة أو واحد إلى 10 بماء Milli Q كما هو موضح في نتيجة اللطخة الغربية هذه ، لم تظهر النباتات التي تم اختراقها بمزارع البكتيريا الزراعية المزروعة في وسائط YEB LB أو AB وتخفيفها باستخدام Milli Q. في متوسط إنتاج GFP من الثقافات التي يتم طردها مركزيا وتعليقها في MMA.

لذلك ، يوصى باستخدام ماء milli Q لتخفيف مزارع البكتيريا الزراعية لتسلل النبات وتم استخدامه بشكل روتيني في التجارب اللاحقة لتحقيق كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5. بعد ذلك ، تم فحص تأثيرات كثافة معلق الخلايا الزراعية والمسار الزمني على التعبير المستهدف. تم تقييم أربعة كثافات مختلفة لتعليق الخلايا من البكتيريا الزراعية التي تحمل PBI 4G FP وتم جمع عينات الأوراق في أربعة وسبعة و 10 أيام بعد التسلل أو DPI لتحليل اللطخة الغربية عند أربعة DPI ، وكانت هناك اختلافات ملحوظة في مضان GFP بين النباتات التي تم اختراقها بكثافات تعليق خلوية مختلفة من البكتيريا الزراعية لم يلاحظ تعبير GFP عند 600 من 0.05 في سبعة D-P-I-G-F-P.

كان التألق مشابها في النباتات التي تم اختراقها عند تعليق الخلية. كثافات 601.0 0.5 و 0.1 ، ولكن كانت أقل من الغرسات تتسلل عند A 600 من 0.05 على النقيض من 10 نقطة في البوصة. لم يلاحظ أي فروق في إنتاج GFP بين النباتات التي تم اختراقها بأي من كثافة معلق الخلايا الأربعة لزيادة تنوع سلالات البكتيريا الزراعية المتاحة لإنتاج البروتين العابر.

تم تسلل نباتات Nicotiana Benham miana بالفراغ مع سبع سلالات مختلفة من البكتيريا الزراعية التي تؤوي ناقل KBI أربعة كيلومترات. تم جمع الأوراق المتسربة عند سبعة DPI وتم تقدير مستوى تعبير كيناز بواسطة اللطخة الغربية. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، تم تحقيق أعلى مستوى من إنتاج الارتباط مع السلالات GV 3 1 10 و 1 A four و LBA 4 4 0 4 مع اختلافات طفيفة.

في حين أن أدنى مستوى للتعبير كان مع C خمسة ثمانية C تم تحقيق إنتاج لياز وسيط واحد مع سلالات T 77 A و T صفر ستة و T 10 تم إثبات النشاط الأنزيمي لياسة باستخدام اختبار XMO Graham. تم استخدام بروتين الليز البكتيري المنقى كعنصر تحكم إيجابي لنشاط الإنزيم. من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن نباتات نيكوتيانا بنهام ميانا التي تسللت مع A four و T سبعة سلالات من النوع البري أظهرت أعراضا مرضية مثل التقزم واستطالة الأليفة والتجعيد وتجعيد الأوراق عند سبعة نقطة في البوصة.

كانت الأعراض خفيفة في نباتات نيكوتيانا بنهام التي تسللت بالنوع البري عند سلالة T 10. لم تلاحظ أي أعراض في نباتات نيكو أوشيانا بنهام التي تسللت بسلالة المختبر GV 3 1 0 1. كشفت مقارنة إنتاج الكتلة الحيوية النباتية في الأنواع البرية أنه في ظل ظروف النمو نفسها ، فإن أعلى كتلة حيوية للأوراق يمكن توليدها من Nico Oceana Excela أعلى بمقدار الضعف تقريبا مقارنة بنيكو أوشيانا

تم فحص إنتاج بروتين بنهام في نيكو أوشيانا بنهام ونيكو أوشيانا إكسلسيور ونيكو أوشيانا إكسيلا الذين تسللوا إلى سلالة البكتيريا الزراعية. تم تقييم تراكم GV 3 1 0 1 الذي يؤوي PBI 4G F-P-G-F-P عند سبعة نقاط في البوصة في الأوراق المتسربة بالكامل. أظهر الفحص البصري لتعبير GFP تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية توزيعا متساويا ل GFP في Nico Oceana Hamana و Nico Oceana Excela وتوزيعا غير متساو في Nico Oceana Excelsior بسبب صعوبة التسلل إلى منطقة أوراق كاملة من Nico Oceana Excelsior أظهر تحليل اللطخة الغربية لتراكم GFP في هذه الأوراق المخللة عند سبعة DPI أن مستوى GFP كان أعلى في Nico Oceana Hamana منه في Nico Oceana Excela و Nico Oceana Excelsior المستوى المنخفض لإنتاج البروتين في نيكو أوشينا.

يرجع Excelsior إلى التسلل غير المتكافئ والتوزيع غير المتكافئ ل GFP المتراكم في الورقة المجمعة. لاختبار تأثير ضغط الفراغ على الأوراق ، تم تسلل نباتات Nico Oceana Benham بسلالة البكتيريا الزراعية ، GV 3 1 0 1 التي تؤوي PBI 4G FP تحت ضغوط فراغ تبلغ 400 أو 200 أو 100 أو 50 مليبار في وقت احتجاز فراغ يبلغ 30 أو 60 ثانية. لم يلاحظ أي فروق في إنتاج GFP وتأثير خفيف أو معدوم على صحة النبات عند تطبيق ضغوط فراغ تبلغ 5 و 100 و 200 مللي بار لمدة 30 أو 60 ثانية.

تم تقييم تأثير مدة الفراغ على التعبير المستهدف عن طريق التسلل إلى شقة واحدة من مصانع Nico Oceana Benham كل ساعة مع A 600 من 0.5 من GV 3 1 0 1 التي تؤوي PBI 4G FP لمدة ثماني ساعات. في نفس الاستزراع الزراعي كما هو موضح في هذه النتيجة التمثيلية ، كان مستوى إنتاج GFP متشابها في جميع الأوقات ، ويشير إلى ثماني ساعات ، مما يشير إلى أنه خلال هذه الفترة الزمنية تحافظ البكتيريا الزراعية على قدرتها على إطلاق حمض نووي واحد تقطعت به السبل. نظرا لأنه تم الإبلاغ عن العديد من المواد الكيميائية والسكريات الأحادية لتعزيز إنتاج البروتين العابر في مختلف الأنواع النباتية.

قيمت هذه الدراسة أيضا تأثير تركيزات مختلفة من الأسيتو والكرينون والجلوكوز. عند إنتاج بروتين GFP العابر في نيكو أوشيانا بنهام ، تسللت آنا بسلالة البكتيريا الزراعية ، GV 3 1 0 1 التي تؤوي PBI 4G FP. نمت البكتيريا الزراعية بين عشية وضحاها في وسائط YEB ، وتم طردها بالطرد المركزي وإعادة تعليقها إلى 600 من 0.5 إما في MMA الذي يحتوي على 2٪ جلوكوز مع مصل الأسيتيل بالتركيزات المشار إليها أو في MMA الذي يحتوي على 200 ميكرومولار أسيتوفينون مع الجلوكوز بالتركيزات المشار إليها. كما هو موضح هنا ، لم تسبب أي من التركيزات المختبرة لهذه المركبات في زيادة كبيرة في إنتاج بروتين GFP مقارنة بالتحكم حيث لا تحتوي وسائط الحث على أسيتوفينون أو جلوكوز.

بعد ذلك ، تأثير التسلل المشترك لمثبط إسكات على التعبير العابر لجينات GFP و HAC في نيكو أوشينا. تم فحص أوراق بنهام قبل التسلل البكتيريا الزراعية GV ، تم خلط ثلاثة ثقافات واحدة واحدة ، وعشر ثقافات تؤوي PBI 4G FP ، ومثبط الإسكات الفيروسي P 19 من فيروس حيلة الطماطم الكثيفة ، على التوالي بنسب واحد إلى واحد ، واثنان إلى واحد ، وثلاثة إلى واحد ، وأربعة إلى واحد. كما يتضح من نتائج تحليل اللطخة الغربية عند سبعة DPI ، فإن وجود P 19 لم يزيد أو ينقص إنتاج GFP في nicotiana Benham Miana بأي نسبة من اثنين من معلقات البكتيريا الزراعية.

بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقيق في تأثير اثنين من مثبطات إسكات الجينات الفيروسية P 23 و P 19 على الوقاية من إسكات الجينات بعد النسخ ل HAC واحد. تم خلط نقاط البيع من البكتيريا الزراعية التي تحمل ناقل الإطلاق PBI أربعة HAC واحد وواحد وواحد من البلازميدات المثبطة للإسكات الفيروسية بنسبة أربعة إلى واحد على التوالي وتسلل مشتركا إلى Nicotiana Bentham Miana. تم جمع عينات الأوراق المتسربة من ثلاثة إلى ثمانية DPI.

يوضح هذا الرسم البياني متوسط مستويات HAC تعبير واحد من ثلاث تجارب على النحو الذي يحدده تحليل اللطخة الغربية. أدى التسلل المشترك ل Nico Oceana Benham مع P 23 أو P 19 إلى زيادة في إنتاج HAC واحد مقارنة بعدم استخدام مثبط إسكات عند 60 pi. يشير هذا إلى أن P 23 و P 19 فعالان في هذا النظام.

لوحظ أيضا أنه في كل من وجود وعدم وجود مثبط إسكات ، بدأ مستوى إنتاج بروتين HAC واحد في الانخفاض عند سبعة DPI. يشير هذا إلى أن توقيت الانخفاض في إنتاج البروتين العابر في نيكو أوشيانا بنهام ميانا المتسلل مع ناقل الإطلاق هو هدف محدد. أخيرا ، يتم تقييم استقرار بنك الخلايا Agrobacterium كل عام عن طريق تسلل نباتات نيكوتيانا بنهام بنفس الدفعة من بنك خلايا Agrobacterium لتقييم تراكم البروتين.

تشير هذه النتائج التمثيلية إلى أن إنتاج بروتين HA one كان مستقرا جدا لأكثر من ثلاث سنوات. يبلغ متوسط إنتاج HAC واحد في مصانع نيكوتيانا بينام 651 زائد أو ناقص 49.4 ملليغرام لكل كيلوغرام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق تقنية التسلل الزراعي لإنتاج البروتينات المؤتلفة على نطاق واسع ، والتي يمكن استخدامها لتصنيع لقاح الوحدة الفرعية ، والأجسام المضادة للبروتين ، والمستضدات التشخيصية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحكم في عبور النبات بشكل مائي ، واستخدام البكتيريا الزراعية القابلة للحياة ، والتحكم في ضغط الفراغ والتحكم في التعبير عن البروتين. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء تقنية الترشيح الزراعي في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح في ظل ظروف خاضعة للرقابة.