تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء لتصور المستجيبة التي سلمت من البكتيريا أثناء الإصابة

الفلورسنت النهج القائم على البروتين لرصد المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلايا المضيفة صعبة. وهذا بسبب عدم التوافق بين نظام إفراز النوع الثالث والبروتينات الفلورية. وهنا، يستخدم نظام تقسيم أمثل للتجارة والنقل سوبيرفولدير للتصور المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلية النباتية المضيف.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين النبات والميكروب مثل كيف يمكن للبكتيريا المسببة للأمراض أن تزعج الحالة المثلى للخلايا النباتية المضيفة باستخدام بروتينات تسمى المؤثرات التي تفرز في الخلايا النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتين المستجيب البكتيري يتم التعبير عنه في الخلية البكتيرية باستخدام نظام التعبير الأصلي الخاص بها ثم يتم توصيله إلى الخلية النباتية من خلال نظام الإفراز البكتيري من النوع الثالث. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد نباتات Nicotiana benthamiana و Arabidopsis thaliana كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، استخدم التثقيب الكهربائي القياسي لتحويل الجين الحامل للبلازميد والمستجيب المدمجة إلى علامة sfGFP11 إلى سلالة CUCPB5500 طماطم Pseudomonas syringae pathovar. تعتمد النقطة الزمنية المثلى ومستوى التعبير ، أو إعادة تكوين sfGFP ، حقا على بروتين المستجيب الخاص بك. نوصي بتحسين ظروف التلقيح أو المراقبة.

انشر الخلايا البكتيرية المحولة برفق على سطح ألواح King's B Agar. ثم احتضان الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. بعد ذلك ، قم بتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في وسط سائل King's B بمضاد حيوي مناسب للناقل

احتضن بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، أضف الجلسرين المعقم إلى الوسط الملقح إلى التركيز النهائي 50٪ يحفظ عند سالب 80 درجة مئوية. للبدء ، قم بتحويل البلازميد إلى Agrobacterium tumefaciens سلالة خلايا GV3101 كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بزراعة الخلايا على وسط LB Agar المكمل عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. باستخدام مستعمرة واحدة من وسط LB Agar ، قم بتلقيح 5 ملليلتر من وسط LB السائل المكمل. ثم قم بزراعة الخلايا بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 3000 غرام لمدة 10 دقائق لحصاد الخلايا. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من عازلة التسلل الطازجة. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، حدد كمية خلايا Agrobacterium عن طريق قياس قيمة الكثافة الضوئية عند امتصاص 600 نانومتر.

بعد ذلك ، استخدم المخزن المؤقت للتسلل لضبط OD 600 للخلايا البكتيرية إلى 0.5. اترك المزرعة على هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى خمس ساعات. للتسلل إلى الأوراق ، استخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر لعمل ثقب في وسط كل ورقة.

استخدم حقنة 1 ملليلتر بدون إبر لحقن 500 ميكرولتر من معلق Agrobacterium بعناية في الجانب المحوري من الورقة. امسح المعلق البكتيري المتبقي من الأوراق وحدد حدود المنطقة المتسللة. احتفظ بالنباتات المتسللة في غرفة نمو عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60٪ لمدة يومين.

قم بربط سلالة Pseudomonas المحولة من مخزون الجلسرين إلى وسط King's B Agar باستخدام المضاد الحيوي المناسب. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. تلقيح حلقة من خلايا Pseudomonas في وسط سائل مانيتول غلوتامات.

احتضن الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 3000 غرام لمدة 10 دقائق لحصاد الخلايا. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في محلول كلوريد المغنيسيوم 10 ملليمول.

بعد ذلك ، اضبط الكثافة الضوئية على 0.02 لأوراق Nicotiana benthamiana و 0.002 لأوراق نبات الأرابيدوبسيس. بالنسبة لأوراق Nicotiana benthamiana ، تسلل إلى معلق Pseudomonas في نفس المنطقة التي تم فيها اختراق Agrobacterium قبل يومين. بالنسبة لأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا ، تسلل إلى معلق Pseudomonas في ورقتين قصيرتين عمرهما أربعة أسابيع.

أخيرا ، قم بقص قرص ورقة للأوراق الملقحة بالسودوموناس. في نقاط زمنية محددة بعد تسلل Pseudomonas ، استخدم نظام مسح ليزر متحد البؤر لتصوير قرصين من الأوراق بسنتيمتر مربع من النبات الفردي. راقب الخلايا بعيدا عن فتحة التسلل لتجنب الخلايا الميتة التي تقتل عن طريق الإصابة.

المؤثرات المنقولة من البكتيريا بكميات صغيرة جدا فقط. لذلك ، يمكنك زيادة قوة الليزر والحصول على انبعاث مضان لاكتشاف إشارة الفلورسنت. ومع ذلك ، لا تفرط في تجنب التقاط إشارة خاطئة من التألق الذاتي من الخلايا النباتية.

في هذه الدراسة ، يتم استخدام نهج قائم على البروتين الفلوري لمراقبة المؤثرات التي تفرزها البكتيريا في الخلايا المضيفة. يظهر هنا فحص ليزر متحد البؤر لورقة Nicotiana benthamiana بعد ثلاث ساعات من الإصابة. لا تظهر الخلايا التي تعبر عن sfGFP المحسن باستخدام AvrB فقط أي إشارة فلورسنت.

ومع ذلك ، تظهر إشارات GFP من الخلايا المصابة التي تحتوي على AvrB و sfGFP11. يتحقق هذا من أن مركب AvrB sfGFP11 يعاد تشكيله باستخدام sfGFP محسن في العصارة الخلوية ثم ينتقل إلى غشاء البلازما. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على صحة المواد النباتية وإعداد زراعة البكتيريا الطازجة للخلايا النشطة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إعداد طرق أخرى مثل تحليل الدم بالراتنج لفهم تعديل الترجمة الخاطئة لبروتينات مستجيب البكتيريا في الخلايا النباتية أثناء الاستجابات المناعية للنبات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور توصيل المستجيب من النوع الثالث في الخلايا النباتية المصابة. يجب التخلص من المواد النباتية ومزارع البكتيريا وفقا لمعايير مختبرك للنفايات الخطرة بيولوجيا ولا تنس ارتداء معدات الوقاية الشخصية الخاصة بك.