تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد إشارة توطين الروابط الهيولية في البروتينات المستهدفة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية عند دراسة الروابط البينية في النباتات من خلال تحديد العناصر الجوهرية في الإشارات التي توجه البروتينات إلى الروابط الهيولية، مما يسهل بدوره نقل الجزيئات الكبيرة من خلية إلى أخرى. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن الإجراء موثوق ويمكن تكييفه بسهولة لاكتشاف تسلسلات إشارة توطين الروابط الهيولية في معظم البروتينات المستهدفة للروابط الهيولية.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات ترشيح النباتات والتحضير للفحص بالمجهر البؤري (confocal) من خلال المنشورات المطبوعة التقليدية. ازرع بذور نبات Nicotiana benthamiana في تربة رطبة وبكثافة عالية. وأثناء نموها، احتفظ بها في غرفة بيئية محكومة عند درجة حرارة تتراوح بين 20 و25 درجة مئوية، وتحت إضاءة لمدة 16 ساعة يومياً، بكثافة ضوئية تبلغ حوالي 75 ميكرومول من الفوتونات لكل متر مربع في الثانية.

بعد أن يصل قطر u. fil إلى نصف سنتيمتر، انقل الشتلات بعناية إلى أصص أكبر وتابع نموها في نفس الغرفة وتحت الظروف ذاتها. حافظ على النباتات حتى تصل إلى مرحلة الأربع إلى ثماني أوراق خلال أربعة أسابيع.

في هذه المرحلة، يجب أن يتراوح قطر أكبر الأوراق بين أربعة إلى ستة سنتيمترات. ومن أجل سهولة التعرف والتحليل، اختر نظام تعبير وقم بتمييز كل بروتين مُعبّر عنه بفلوروسنت كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. قم بتحضير بلازميد مستند إلى pPZP-RCS2 كما هو موضح، وأضف 1 µg منه إلى مزرعة بحجم 100 µL من الخلايا المختصة لـ Agrobacterium tumefaciens.

قم بتحضين الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتجميد الخلايا تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بتدفئة الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وأضف بعد ذلك 1 مل من وسط LB إلى خليط الخلايا المختصة.

بعد إضافة وسط LB، أعد الخلايا إلى درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بتركيز الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3, 000 ×g لمدة دقيقة واحدة. أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في 0.2 milliliters من وسط LB وازرعها على أطباق أغار LB ذات الانتقائية للمضادات الحيوية.

قم بنمذجة الخلايا على الأطباق عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى تظهر المستعمرات الفردية. بعد ذلك، اختر عدة مستعمرات فردية وانقلها إلى أطباق LB agar جديدة، ثم نمِّ الخلايا عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تالياً، خذ كمية صغيرة من البكتيريا من كل طبق للتحليل، واستخدم تقنية Colony PCR للتأكد من وجود البناءات الثنائية المحددة المطلوبة.

أضف كل مستعمرة من بكتيريا agrobacterium التي تحتوي على البنية الجينية المطلوبة إلى خمسة ملليمترات من وسط LB المضاف إليه المضادات الحيوية المناسبة. قم بتنمية الخلايا طوال الليل عند 28 درجة Celsius. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 3,000 ×g. ثم أعد تعليق الراسب للوصول إلى قيمة OD600 تبلغ 0.5 في محلول منظم agroinfiltration.

يُحضن المعلق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم تحميل اللقاح في حقنة بلاستيكية سعة 1 مل. مع تثبيت ورقة ناضجة تماماً من نبات N.Benthamiana بإصبع يرتدي قفازاً على الوجه العلوي، يتم ضغط فوهة الحقنة مقابل البشرة السفلية للورقة. بعد ذلك، يتم إدخال agrobacterium في وسط الارتشاح ببطء عن طريق حقن الوسط.

يُحتفظ بالنبات المُرشح حتى يحين موعد ملاحظته. استعن بشفرة لتقطيع كل ورقة إلى شظايا بين العروق بعد مرور 24 إلى 48 ساعة من عملية الترشيح. ضع شرائح الأوراق على الشريحة الزجاجية بحيث يكون السطح الظهري للورقة متجهًا للأعلى.

بعد ذلك، ضع قطرة من الماء على شريحة الورقة وغطها بغطاء الشريحة. قم بتثبيت غطاء الشريحة بقطع صغيرة من الشريط اللاصق على كل جانب. انقل الشريحة إلى المجهر البؤري الماسح بالليزر واستخدم عدسة شيئية بقوة 10X لتحديد الخلايا التي تعطي أفضل إشارة.

بعد ذلك، استخدم عدسة شيئية بقوة 63X لتسجيل الصور من أجل إجراء ملاحظات أكثر تفصيلاً. بالإضافة إلى ذلك، استخدم الفلوريسنتات المناسبة لإثارة البروتينات الفلورية المُعبّر عنها. احتفظ بجميع الإعدادات المستخدمة في عملية الحصول على الصور لضمان الاتساق بين التجارب.

افحص في المتوسط من 100 إلى 120 خلية لكل حالة تجريبية. حدد موقع تموضع البروتينات المختبرة باستخدام صور المجهر البؤري. توضح هذه الصور أنماط تموضع البلازموديزمات النقطية المحيطية المميزة التي لوحظت لبروتين حركة TMV كامل الطول المدمج مع جزيء الشحنة CFP، ولإشارة تموضع البلازموديزمات المحددة المدمجة مع CFP، وكذلك لبروتين تموضع البلازموديزمات الذي تم التعبير عنه بشكل مشترك، PDCB1 المدمج مع DsRed.

في ظل ظروف التحكم، يظهر استهداف الروابط الهيولية (plasmodesmata) لبروتين حركة TMV كامل الطول المدمج بـ CFP وإشارة التوطين في بروتين حركة TMV المدمج بـ CFP كما هو موضح هنا، مع توطين CFP تحت خلوي وتوطين النواة والسيتوبلازم لعلامة DsRed2. وعندما يتم تحويل الحمض الأميني الرابع، الفالين، إلى ألانين، يُفقد استهداف الروابط الهيولية بواسطة كل من بروتين حركة TMV كامل الطول وإشارة التوطين المحددة في بروتين حركة TMV. وهذا يشير إلى أن هذه الثمالة مهمة لبنية أو وظيفة إشارة توطين الروابط الهيولية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 50 ساعة إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة أن تكون النباتات في حالة صحية جيدة جداً وفي مرحلة نمو ورقية مناسبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد، ليس فقط لكيفية تحديد إشارة بروتين توضع الروابط السيتوبلازمية (plasmodesmata localization protein signal)، بل وأيضاً كيفية تحديد إشارات معينة أخرى في بروتينات النبات.