الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة استشعار لتقدير حجم انتشار غشائي، الحاجز وظيفة، والحركة

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام استشعار مقاومة ركيزة الخلية الكهربائية المعروف باسم eis لتوصيف السلوكيات الخلوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا على أقطاب كهربائية في مصفوفة وأخذ القياسات في أوضاع مختلفة لتحديد تكوين الحاجز البطاني ، والنضج والتلاعب بالوظيفة مثل الجرح الكهربائي وإضافة المنشطات لاختبار حركة الخلية ووظيفة الحاجز. تم الحصول على النتائج التي تصف ارتباط الخلية ، والتكاثر ، والهجرة ، والكشف عن نفاذية البطانة ، وتقييم ملامسات الركيزة للخلايا والخلايا والخلايا بناء على esis.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البيولوجي للخلية ، مثل توفير توليد البيانات الكمية عبر الإنترنت ، وتوصيف الخلايا في حالة التقائها الطبيعي في ظروف زراعة الخلايا القياسية. بشكل عام ، يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة من النضال لأن النظرية الأساسية تبدو معقدة ويجب أن تكون على دراية بالعديد من الاعتبارات الأساسية قبل بدء التجربة. للبدء ، يجب تنظيف المصفوفات وتثبيتها لمنع انجراف القطب الكهربائي ، وتحسين قابلية التكرار ، وزيادة نسبة قوة الإشارة.

لذلك ، أضف 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار EL ine إلى كل بئر من مجموعة ثمانية آبار بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة EL cystine بغسلتين مائي فائقتين ، وليس مخازن فوسفات. أيضا ، لا تعرض الأقطاب الكهربائية للمحاليل المحتوية على المصل قبل الطلاء لأنها يمكن أن تتداخل مع امتصاص البروتين. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الجيلاتين الدافئ بنسبة 1٪ إلى كل بئر واحتضان المصفوفة لمدة نصف ساعة عند 37 درجة مئوية.

لإزالة الجيلاتين ، استخدم الماء عالي النقاء ولا تسمح لأسطح القطب بالجفاف. ثم املأ الآبار ب 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل ، والذي يمكن أن يحتوي الآن على المصل. قم بتحميل المصفوفة في الحامل.

تحقق من المربعات الذهبية التسعة. يجب عليهم الاتصال بدبابيس POGO. قم بتأمين المصفوفة في مكانها يدويا بعناية ، وشد برغي الضبط على الكمبيوتر.

افتح برنامج القياس. اضغط على إعداد ثم تحقق من قسم جمع البيانات لإجراء قياس معاوقة سريع لكل بئر بالتردد الافتراضي البالغ 4،000 هرتز. سيتم تخزين القيم في قسم التعليقات.

تأكد من أن الفحص اختار بدقة نوع مصفوفة EISs المستخدمة ضمن قسم تكوين البئر في مخطط المصفوفة. يشير اللونان الأحمر والأخضر إلى وظيفة الاتصالات. إذا نجح التنظيف والترميز ، فيجب أن تسجل ثماني مصفوفات W one E sys حوالي خمسة إلى ستة مصفوفات NANOFARAD وثمانية مصفوفات W 10 E.

مقاومة خط الأساس من 50 إلى 60 نانوفاراد قبل تلقيح الخلايا هي حوالي 2000 أوم. لنمذجة البيانات باستخدام RB alpha و cm، ابدأ تسجيل MFT باستخدام المصفوفة الفاشلة المتوسطة. خذ 15 دقيقة من البيانات الخالية من الخلايا وقم بإنهاء التجربة لإضافة الخلايا.

الآن قم بإزالة المصفوفة وبذرة 400 ميكرولتر من تعليق الخلية المفردة في كل بئر. لدراسة بذور نمو الخلايا ، 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع لتبدأ ببذور سكانية ملتقية تقريبا ، 60،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. بعد تحميل المصفوفة في الحامل ، ضمن قسم تكوين البئر ، حدد الآبار المراد قياسها.

ثم انتقل إلى خيارات جمع البيانات وحدد وضع القياس لسلسلة زمنية بتردد ثابت ، حدد SFT ، واختر تردد القياس لقياس تغطية القطب الكهربائي ونموذج RB و alpha حدد MFT وسيقوم الجهاز تلقائيا بأخذ القياسات في جميع الترددات المتاحة. قم بتشغيل القياس على وضع التردد المتعدد كلما أمكن ذلك. يتطلب هذا بيانات بجميع الترددات المتاحة وبالتالي يوفر معظم الرؤى.

لتحليل الحركة الدقيقة ، حدد RTC واضبط تردد أخذ العينات. الدقة الزمنية القياسية هي هرتز واحد ، ولكن يمكن زيادتها لتتبع التغييرات السريعة في المقاومة. يمكن زيادة القيمة إلى 25 هرتز ل z theta.

لقياس الحركة الدقيقة بالتتابع من العديد من الآبار ، حدد قائمة المساعدة. ثم اختر إظهار عناصر قائمة شريط الأدوات الخبير والحصول على RTC وتعدد الآبار. في قسم جمع البيانات، تأكد من تحديد الحد الزمني بالساعات.

عند استخدام هذا الإعداد، سيطالب البرنامج بعدد الدورات بعد بدء الحصول على البيانات. عند جمع البيانات باستخدام SFT أو MFT، حدد الفاصل الزمني بين القياسات المحددة بالثواني. للحصول على الحد الأقصى للحصول على البيانات، اترك هذا الخيار دون تحديد.

الآن اضغط على ابدأ وحدد المكان الذي يجب تخزين البيانات فيه. توقف الجري بالضغط على النهاية. بالضغط على إيقاف مؤقت ، سيتوقف الحصول على البيانات ، لكن الساعة التجريبية ستستمر في العمل.

الآن قم بإزالة المصفوفة وتحت غطاء التدفق الصفحي ، قم بمعالجة الآبار. بعد إرجاع المصفوفة إلى الحامل، انقر فوق التحقق من الاتصال للتحقق من التوصيلات الكهربائية ثم استأنف التجربة لمتابعة جمع البيانات. إذا لم تكن الخلايا بحاجة إلى أن تكون معقمة بعد التلاعب ، فيمكن إضافة حافز مثل الثرومبين مباشرة إلى البئر أثناء الحصول على البيانات.

يمكن تمييز هذه الاختلافات التي تم إدخالها على الساعة التجريبية بالضغط على العلامة وإضافة تعليق. خيار آخر هو جرح الخلايا كهربائيا. تحتاج الإعدادات الخاصة بذلك إلى بعض التغيير والتبديل للوصول إلى وقت الجرح القصير وهي ليست فعالة لفترة طويلة جدا ، ويمكنك إتلاف الأقطاب الكهربائية.

ما عليك سوى البدء بالإعدادات الافتراضية التي يوفرها البرنامج والانتقال من هناك. انتقل إلى قسم إعداد العرض الكهربائي للجرح وقم بتمكين الجرح. الآن حدد الآبار المراد جرحها تحت تكوين البئر.

جرح الآبار التي تم فحصها فقط. يؤدي النقر فوق تنشيط إلى إظهار نافذة منبثقة للمطالبة بالجرح. بعد الجرح ، تأكد من أن الإشارة تنخفض إلى قيمة قطب كهربائي خال من الخلايا تقريبا.

إذا لم يكرر الجرح بشكل عام للعمل مع البيانات ، فاستخدم خيار تصدير البيانات وحدد Excel. ومع ذلك ، يمكن إجراء نمذجة RB و alpha من داخل البرنامج. من بيانات MFT ، تذكر أن النمذجة صالحة فقط في طبقات خلايا التقاء.

ولا تنس إضافة المرجع الخالي من الخلايا. ابدأ بتحديد مرجع خال من الخلايا تلقائيا باستخدام وظيفة البحث ضمن قسم نمذجة وتحليل مسح التردد. اقبل القيمة مع المجموعة.

بعد ذلك اضغط على النموذج لبدء العمليات الحسابية. لا تنزعج إذا استغرق ذلك عدة دقائق. خلال تجربة نموذجية ، تنتقل الخلايا من مرحلة النمو إلى مرحلة الهضبة.

عندما تصل إلى التقاء ، يتم الحصول على الصور مباشرة من القطب أثناء هذه العملية. المرحلة التالية هي تشكيل ونضج حاجز EC. ثم يتم استخدام الجرح الكهربائي لدراسة هجرة الخلايا.

يتبع الانخفاض المميز للإشارة إلى خط الأساس إعادة إنشاء حالة الالتقاء. أخيرا ، يتم اتباع الاستجابة للمنبهات في الوقت الفعلي. هنا ، تم تطبيق عامل الأوعية الدموية الثرومبين.

تسبب هذا في الانكماش الخلوي وبالتالي الفتح العابر للفجوات الصغيرة في الحاجز ، مما تسبب في انخفاض في مقاومة المعاوقة وقياسات السعة التي تنتج معلومات تكميلية عن التصاق الخلية ومقاومة النمو في القياس الأكثر حساسية. يمثل التردد جودة ووظيفة حاجز الخلية ويأخذ في الاعتبار المقاومة لتدفق التيار شبه الخلوي وعبر الخلايا. عندما ترتبط الخلايا بالأقطاب الكهربائية ، فإنها تقيد تدفق التيار وانخفاض السعة بشكل متناسب.

توفر هذه المرحلة قياسا شاملا لتغطية القطب الكهربائي ويتم تحديدها بشكل أفضل عند تسجيل السعة بتردد أعلى من 40 كيلو هرتز. تعطي المقاومة فكرة واضحة عن كيفية قدرة الخلايا الجيدة على منع التدفق الحالي وبالتالي جودة حاجز الخلية. لذلك ، فإن الخلايا ذات الممرات المختلفة والأنواع المختلفة لها مقاومات مختلفة.

يساعد RB و alpha على التمييز بين التصاقات خلية الخلية ومصفوفة الخلية. RB هي مقاومة ملامسات الخلايا الخلوية للتدفق الحالي ، أو قياس عكسي للنفاذية. ألفا هو مقياس لمساهمات المعاوقة من تقاطعات قطب الخلية.

يمكن حساب كل من قيم RB و alpha من داخل برنامج ISIS. يمكن أن تكون التقلبات الصغيرة في إشارة المقاومة ناتجة عن حركات خفية في طبقة خلية التقاء أو الحركة الدقيقة. يمكن قياسها باستخدام مصفوفات E واحدة عند التردد الأكثر حساسية وتحليلها عن طريق تحويل فورييه السريع داخل التلاعب ببرنامج EISs الذي يعطي نظرة ثاقبة للسلوك الخلوي يمكن إجراؤه بدقة.

على سبيل المثال ، من الممكن عمل جرح كهربائي بحجم 250 ميكرون يغلق في غضون ساعات قليلة لدراسة هجرة الخلايا. التحليل الطيفي للمقاومة مناسب أيضا لتحليل تأثير المواد المضافة. كما ذكرنا سابقا ، يجعل الثرومبين حاجز الخلية شديد النفاذية عن طريق خفض توتر الخلايا القاعدية باستخدام مثبط ARO kinase ، ويمكن أن يتضاءل تأثير الثرومبين أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن ESIS حساس للغاية للتغيرات في بيئة الخلية مثل درجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، والاستنفاد المتوسط ، وما إلى ذلك.

بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم لدراسة اتجاهات وتأثيرات العوامل النشطة للأوعية على مزارع خلايا التقاء في الوقت الفعلي.