على الإحاطة الفحص: بروتوكول لتقييم التفاعلات بين الخلايا العصبية والجهاز العصبي المركزي البالعات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس ابتلاع مدخلات ما قبل المشبكي بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن متتبعات الدرجة الأمامية الفلورية أولا في العينين لتسمية مدخلات ما قبل المشبكي للخلايا العقدية الشبكية في النواة الجانبية الجانبية. الخطوة الثانية هي تشريح الدماغ وإصلاحه وتوازنه.

بعد ذلك ، يتم تقسيم الدماغ. الخطوة الأخيرة هي تركيب أقسام الدماغ على شفة الغطاء للتصوير والتحليل. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم ابتلاع مدخلات ما قبل المشبكي بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيف تساهم التربة البلعمية في مرونة الدائرة المشبكية وإعادة تشكيلها. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لإعادة تشكيل الدوائر المشبكية في الدماغ السليم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل إعادة تشكيل الدوائر المشبكية أثناء أمراض الجهاز العصبي. سيوضح الإجراء كريس هيلر ، الفني ، وإميلي لامان ، طالبة الدراسات العليا من مختبر ستيفنز.

ابدأ هذا الإجراء بتخدير الماوس بفلور ISO 4٪ في غرفة تحريض زجاج شبكي. بعد دقيقة إلى ثلاث دقائق ، تأكد من تحقيق مستوى مناسب من التخدير عن طريق الضغط على الذيل. ثم ضع الماوس على جانبه تحت المجهر الاستريو وضع مخروط الأنف ، والذي يوفر ثلاثة إلى 4٪ من فلور ISO فوق الخطم.

لفضح الصلبة ، استخدم مقصا زنبركيا صغيرا لفتح الجفن وسحب الجلد للخلف. بالنسبة لحديثي الولادة ، في بعض الأحيان يكون من الضروري إجراء قطع عمودي آخر في زاوية العين. كن حذرا عند قطع زاوية الجفن حيث يوجد وعاء دموي.

استخدم إبرة معقمة بقياس 30.5 لثقب ثقب صغير في جانب العين حيث تبدأ الصلبة. احرص على تجنب إتلاف العدسة عن طريق إدخال الإبرة بعيدا بما يكفي بحيث يدخل الشطبة في العين. اسمح للزجاج بالتدفق من الحفرة واستخدم قطعا معقما وقضيبا مائلا لامتصاص السائل.

بمجرد توقف الجسم الزجاجي عن التدفق من الحفرة ، أدخل ببطء إبرة غير حادة متصلة بحقنة هاميلتون التي تم تحميلها مسبقا بتتبع الدرجة الأمامية. صبغ في الحفرة ، وحقن الصبغة ببطء في العين. عادة ، يتم استخدام الوحدة الفرعية لبيتا توكسين الكوليرا المقترنة ب Alexa 5 94 أو 6 أو 47 أو 4 88 في الدرجة الأمامية.

مدخلات التتبع المتأخر R GC اترك الإبرة في الحفرة لبضع ثوان ثم قم بإزالتها ببطء. استخدم قضيب قطني ذو رأس لامتصاص السوائل الزائدة ومنع تسرب الصبغة. ثم ضع كمية صغيرة من مرهم المضادات الحيوية على العين.

إذا تم فتح العين جراحيا. أعد وضع الجفون معا برفق بعد الحقن. اترك الماوس تحت مصباح حراري أو على وسادة حرارية حتى يبدأ في التعافي من التخدير.

أعد الفأر إلى قفص منزلي نظيف وراقبه للتأكد من أنه مستيقظ تماما قبل إعادته إلى المستعمرة. بعد حوالي 24 ساعة من الحقن ، ضحي بالفأر وتشريح الدماغ. قم بإصلاح الدماغ في أنبوب فالكون مملوء بنسبة 4٪ PFA بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

اشطف الدماغ ثلاث مرات في PBS عن طريق سكب الدماغ و PFA أولا في قارب مصل اللبن الفارغ ثم استخدم ملعقة لنقل الدماغ إلى قارب مصل اللبن الآخر المليء ب PBS. اغسل الدماغ مرتين أخريين في PBS قبل نقله إلى أنبوب فالكون مملوء بمحلول السكروز بنسبة 30٪. اتركه في السكروز عند أربع درجات مئوية حتى يغرق في قاع الأنبوب.

بعد ذلك ، قم بإزالة أي أجزاء من الدماغ غير ضرورية بشفرة حلاقة. قم بتجميد الدماغ على قطعة من رقائق الألومنيوم فوق الثلج الجاف. في غضون ذلك ، قم بتجميد مرحلة الميكروتوم واملأ كل بئر من صفيحة 24 بئر بنصف مليلتر من 0.1 مولار PP لتركيب الدماغ المتجمد في مرحلة التجميد.

ضع كمية صغيرة من OCT على المسرح. بمجرد أن يبدأ OCT في التجمد ، ضع الدماغ فيه. يجب أن يكون جانب الدماغ الذي سيتم قطعه متجها لأعلى.

بعد ذلك ، قم بتغطية الدماغ و OCT بالثلج الجاف المطحون جيدا. اترك الثلج الجاف على الدماغ لمدة 30 ثانية تقريبا. ثم استخدم فرشاة طلاء كبيرة لإزالة الثلج الجاف.

ابدأ في تقسيم الشرائح بسمك 40 ميكرون. ثم استخدم فرشاة رسم صغيرة رطبة لإزالة الأقسام التي تحتوي على منطقة الاهتمام من الشفرة ونقلها إلى صفيحة 24 بئر تحتوي على 0.1 مولي رصاص. بمجرد جمع الأقسام ، تصور ملصقات الدرجة الأمامية تحت مجهر تشريح الفلورسنت واختر الأقسام التي تحتوي على المنطقة ذات الاهتمام لتركيب الأقسام على شريحة.

أولا ، ضع مجموعة صغيرة من 0.1 مولار PB على مجهر مشحون. حرك بعد ذلك ، انقل أقسام الأنسجة إلى بركة الرصاص. ثم استخدم فرشاة الرسم لتوجيه الأنسجة ونشرها.

استخدم مناديل Kim لفتل XSPB واحرص على تجنب فتل القسم. دعهم يجفوا تماما في الهواء. ثم ضع قطرة صغيرة من وسيط التثبيت على كل قسم وقم بتركيب زلة غطاء في الأعلى في النهاية.

ختم حواف الشريحة بطلاء الأظافر. قم بتخزين الشريحة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تظهر جلسة التصوير. فيما يلي مخطط لاستراتيجية تتبع الدرجة الأمامية.

يتم تتبع مدخلات RGC للعين اليمنى واليسرى باستخدام CTB 6 47 و CTB 5 94 على التوالي. يتم لاحقا تقييم ابتلاع المدخلات بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة. فيما يلي صورة تمثيلية منخفضة التكبير لليوم الخامس للفأر DLGN بعد التتبع التدريجي لمدخلات العين اليمنى واليسرى.

هذه هي الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم أخذ عينات منها من المنطقة الحدودية لمدخلات العين اليمنى واليسرى. تم طرح كل مضان CTB خارج حجم الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يكشف عن مدخلات RGC التي تم ابتلاعها والعرض السطحي للخلايا الدبقية الصغيرة وابتلاعها. يتم عرض مدخلات RGC هنا.

هنا هو السطح التمثيلي الظاهر الصغير الذي تم تقديمه من فأر P five و P تسعة و P 30. يزداد ابتلاع DLGN لمدخلات RGC بشكل كبير أثناء ذروة التقليم في DLGN مقابل الأعمار الأكبر سنا. الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران التي تعاني من نقص في المستقبلات التكميلية ثلاثة تبتلع مدخلات RGC أقل بكثير مقارنة برفقاء القمامة من النوع البري بمجرد إتقانها.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تداخل الخلايا العصبية الملصقة وتقييم تفاعلات المشبك الدبقية الصغيرة.