تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الوظيفة البلعومية للخلايا الدبقية الصغيرة في الشبكية داخل الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال طب العيون، مثل ما إذا كانت مركبات معينة تغير الوظيفة البلعومية للخلايا الدبقية الصغيرة في بيئة فسيولوجية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام قياس التدفق الخلوي، مما يسمح بإجراء تحليل كمي سريع ودقيق لعملية البلعمة في الخلايا الدبقية الصغيرة.

سيساعدني في توضيح الإجراء Susumu Sakimoto، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بتعبئة إبرة قياس 33 ومحقنة بـ 0.5 µL من محلول الجسيمات المسمى فلورياً. ثم ضع فأراً مخدراً بشكل جانبي على مادة ناعمة تحت مجهر جراحي، وتحقق من مستوى التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرص أصابع القدم.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً لتسليط ضغط دقيق حول أحد الجفنين، بحيث تبرز مقلة العين قليلاً من المحجر. ثم أمسك الرأس بإصبعين فوق الأذن مباشرة وبفك الحيوان، وشد الجلد برفق بشكل موازٍ للجفون للحفاظ على بروز العين قليلاً من المحجر. تُعد الحقن داخل الجسم الزجاجي صعبة، وإذا لم تُنفذ بشكل صحيح، ستؤدي إلى نتائج متحيزة ومتغيرة.

للحد من إصابة العين، يجب تثبيت الحيوان في وضعية مستقرة مع تقليل حركة الرأس إلى أدنى حد. ولثقب مقلة العين، أمسك الفأر برفق بيد واحدة، ثم حدد موقع الليمب القرني حيث تلتقي القرنية مع الصلبة، والذي يظهر كدائرة رمادية في الفئران الملونة.

أمسك المحقنة باليد الأخرى، ثم أدخل الإبرة في الحافة (limbus). بعد ذلك، اسحب الإبرة قليلاً لطرد حجم صغير من السائل الزجاجي، واضغط على المكبس ببطء لحقن الجسيمات. عند الانتهاء من توصيل جميع الخرزات، اسحب المحقنة ببطء لتجنب ارتداد المادة المحقونة، ثم ضع قطرات مرطبة للحفاظ على رطوبة العين بمجرد عودتها إلى وضعها الطبيعي.

بعد ذلك، ضع الحيوان على وسادة تدفئة في قفص خاص به مع مراقبته حتى يتعافى تماماً. بعد ثلاث ساعات من الحقن داخل الجسم الزجاجي، استخدم ملقطاً بزاوية 45 درجة للضغط برفق على الجفن لإبراز مقلة العين. ضع الملقط خلف مقلة العين ثم اسحبها.

بعد ذلك، انقل مقلة العين إلى منطقة جافة في طبق بتري، يحتوي على حجم صغير من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم تحت مجهر تشريحي. واستخدم طرفاً واحداً من ملقط فائق الدقة لثقب العين عند الحوف القرني. بعد ذلك، أمسك مقلة العين بملقط دقيق بزاوية 45 درجة، واستخدم مقصاً نابضاً للقص حول الحوف القرني حتى يتم قص نصف المحيط تقريباً.

انقل مقلة العين إلى محلول PBS واستخدم زوجاً ثانياً من الملاقط الدقيقة بزاوية 45 درجة لتمزيق القرنية والصلبة وفصلهما عن بعضهما. ستخرج العدسة والشبكية سليمتين. تأكد من فصل العدسة عن الشبكية، ثم انقل الشبكية إلى أنبوب اختبار من البوليسترين سعة 5.4 milliliter، يحتوي على 2 milliliters من محلول PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم.

للحصول على معلق خلوي أحادي من خلايا الشبكية، استخدم طقم تفكيك الأنسجة العصبية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم أعد تعليق الخلايا في 200 µL من محلول التلوين المنظم. بعد ذلك، انقل العينة إلى بئر واحد من طبق ذو قاع على شكل حرف U يحتوي على 96 بئراً. بعد الطرد المركزي، اقلب الطبق للتخلص من الطافي، ثم قم بحجب مستقبلات FC باستخدام 25 µL من محلول التلوين المنظم الذي يحتوي على أجسام مضادة CD16 وCD32 لكل بئر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بوسم الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المطلوبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. ثم قم بترسيب الخلايا متبوعاً بعملية غسيل باستخدام 200 µL من منظم التلوين الطازج لكل بئر. الآن، أعد تعليق الرواسب في 200 µL من منظم التلوين وصبغة الحيوية، وانقل العينات إلى أنابيب ميكروتيتر سعة 1.2 mL.

بعد ذلك، اغسل الآبار بـ 100 µL إضافية من محلول التلوين وصبغة الحيوية، واجمع نواتج الغسيل مع العينات المقابلة لها لتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام هذه الطريقة في الفئران حديثة الولادة التي يتراوح عمرها بين 10 إلى 20 يوماً أو في الفئران البالغة، كما يمكن تطويعها لاختبار تأثير المركبات و/أو التلاعب الجيني في عملية البلعمة للخلايا الدبقية الصغيرة. على سبيل المثال، في هذه التجربة، بعد التحفيز داخل الصفاق بجرعات متفاوتة من LPS، تبيّن أن جرعة 1.42 mg/kg من LPS أدت إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة البالعة، مقارنة بالمجموعات الضابطة التي حُفزت بالمحلول الناقل.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ست ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وعقب تطبيق هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل فرز الخلايا متبوعاً بـ qPCR أو التحليل البروتيني، للإجابة على تساؤلات إضافية حول الاختلافات بين الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية وغير البلعمية في الشبكية. ومن خلال تطوير هذه التقنية، نتوقع أن نتمكن الآن من تمكين علماء الرؤية وعلماء الأعصاب من إجراء المزيد من الاستكشافات حول الوظيفة البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة في الموقع (in situ) وفي سياق ذي صلة فسيولوجياً.