تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة في فيفو باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم وظيفة البلعمة للدبقية الصغيرة في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب العيون ، مثل ما إذا كانت بعض المركبات تغير وظيفة البلعمة الدبقية الصغيرة في بيئة فسيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بتحليل كمي سريع ودقيق للبلعمة الدبقية الدقيقة.

سيساعدني في إثبات الإجراء سوسومو ساكيموتو ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بتحميل إبرة وحقنة عيار 33 ب 0.5 ميكرولتر من محلول الجسيمات المسمى بالفلورسنت. ثم ضع فأر مخدر جانبيا على مادة ناعمة تحت المجهر الجراحي وتأكد من المستوى المناسب من التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.

بعد ذلك ، استخدم الملقط للضغط بعناية حول جفن واحد ، بحيث تنبثق كرة العين قليلا من التجويف. ثم أمسك الرأس بإصبعين فوق الأذن وفك مباشرة ، وقم بتمديد الجلد برفق بالتوازي مع الجفون للحفاظ على العين منتفخة قليلا خارج التجويف. تعتبر الحقن داخل الجسم الزجاجي صعبة ، وإذا لم يتم إجراؤها بشكل صحيح ستؤدي إلى نتائج متحيزة ومتغيرة.

لتقليل صدمة العين ، امسك في وضع مستقر مع الحد الأدنى من حركة الرأس. لثقب مقلة العين ، أمسك الماوس برفق بيد واحدة. ثم حدد موقع أطراف القرنية حيث تتصل القرنية والصلبة ، والتي يمكن رؤيتها كدائرة رمادية في الفئران المصطبغة.

أمسك المحقنة في اليد الأخرى ، أدخل الإبرة في الليمفا. ثم اسحب الإبرة قليلا لطرد كمية صغيرة من السائل الزجاجي ، واضغط ببطء على المكبس لحقن الجسيمات. عندما يتم تسليم جميع الخرزات ، اسحب المحقنة ببطء لتجنب ارتجاع المادة المحقونة وقم بتطبيق قطرات مرطبة للحفاظ على ترطيب العين بمجرد تراجع العين إلى مكانها.

ثم ضع على وسادة تدفئة في قفصه الخاص مع المراقبة حتى يتم تعافيه تماما. بعد ثلاث ساعات من الحقن داخل الجسم الزجاجي ، استخدم ملقطا بزاوية 45 درجة للضغط برفق على الجفن لتحفيز مقلة العين. ضع الملقط خلف مقلة العين واسحبه.

ثم انقل مقلة العين إلى المنطقة الجافة من طبق بتري ، الذي يحتوي على كمية صغيرة من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم تحت مجهر تشريح. واستخدم طرفا واحدا من ملقط فائق النعومة لثقب العين في طيف القرنية. بعد ذلك ، أمسك مقلة العين بملقط بزاوية 45 درجة ، استخدم مقصا زنبركيا لقطع أطراف القرنية حتى يتم قطع نصف محيط ما يقرب من

انقل مقلة العين إلى PBS واستخدم زوجا ثانيا من الملقط الناعم بزاوية 45 درجة لتمزيق القرنية والصلبة. ستخرج العدسة وشبكية العين سليمة. تأكد من فصل العدسة وشبكية العين ونقل الشبكية إلى أنبوب اختبار البوليسترين سعة 5.4 ملليلتر ، يحتوي على ملليلترين من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم.

للحصول على معلق خلية واحدة لخلايا الشبكية ، استخدم مجموعة تفكك الأنسجة العصبية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. ثم انقل العينة إلى بئر واحد من صفيحة قاع على شكل حرف U سعة 96 بئرا. بعد الطرد المركزي ، قم بقلب اللوحة للتخلص من المادة الطافية وسد مستقبلات FC ب 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للبقع الذي يحتوي على CD16 ، الجسم المضاد CD32 لكل بئر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة ذات الأهمية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم قم بتكسير الخلايا واتبع ذلك بغسل 200 ميكرولتر من مخزن التلوين الطازج لكل بئر. الآن قم بتعليق الكريات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبقع وصبغة الجدوى وانقل العينات إلى أنابيب ميكروتيتر سعة 1.2 مل.

ثم اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للتلطيخ وصبغة الجدوى وتجمع الغسالات مع العينات المقابلة لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام هذه الطريقة في الفئران البالغة بعد الولادة أو الفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 10 و 20 يوما ويمكن تكييفها لاختبار تأثير المركبات و / أو التلاعب الجيني بالبلعمة الدبقية الدقيقة. على سبيل المثال ، في هذه التجربة بعد التحدي داخل الصفاق بجرعات متفاوتة من LPS ، تم تحديد 1.42 ملليغرام لكل كيلوغرام من جرعة LPS لإحداث زيادة ذات دلالة إحصائية في النسبة المئوية للخلايا الدبقية البلعمية ، مقارنة بعناصر التحكم التي تواجه تحديا في السيارة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل فرز الخلايا متبوعة ب qPCR أو التحليل البروتيني ، للإجابة على مزيد من الأسئلة حول الاختلافات بين الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية وغير البلعمية في شبكية العين. عند تطوير هذه التقنية ، نتوقع أن نتمكن الآن من تمكين علماء الرؤية والأعصاب من استكشاف وظيفة البلعمة الدبقية الدقيقة في الموقع وفي سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية.