تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفات دقيقة للأغشية الحيوية باستخدام طريقة تحضير بسيطة. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء حبات السيليكا أولا بأغشية ثنائية الطبقة دهنية. الخطوة الثانية من الإجراء هي إيداع الخرز المطلي بالدهون على ركيزة سيليكون مايكروويل.

الخطوة الثالثة هي إزالة الخرزات غير الموجودة في الآبار الصغيرة ، باستخدام ممسحة بولي ميثيل سوبوكسان. الخطوة الأخيرة هي تصوير مصفوفات الخرز المطلية بالدهون باستخدام الفحص المجهري الفلوري. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد ثوابت الربط لتفاعلات الدهون السمية باستخدام نهج تصوير المصفوفة.

يمكن استخدام هذه الطريقة لإنشاء مصفوفات من الطبقات الدهنية المدعومة كروية وجزيئات الغشاء الطبيعي المشتقة من الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه بصرف النظر عن تصنيع الآبار الصغيرة ، لا تتطلب التقنية أي تعديل كيميائي للركيزة أو الأغشية الدهنية لإنشاء مصفوفات غشاء حيوي محددة مكانيا. يمكن توسيع تطبيقات هذه التقنية لتشمل الكشف الحر عن تفاعلات البروتين الدهني باستخدام البلازما السطحية والرنين بناء على مصفوفات الثقب المعدنية النانوية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات البروتين الدهني ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل دراسات الالتصاق البؤري الخلوي ، ومصفوفات الآبار الدقيقة ومستحضرات الممسحة مفصلة في بروتوكول النص. يبدأ هذا الفيديو بتحضير الحويصلة. أولا في مزيج زجاجي صغير ، الدهون المكونة للحويصلات.

يوجد ما مجموعه نصف ملليغرام من الدهون في هذا المحلول تحت الفراغ ، وتجفيف الخليط لمدة ست ساعات. بعد ذلك ، اصنع محلول كلوريد الصوديوم 0.1 مولار وأضف نصف مليلتر إلى الدهون المجففة. دع الخليط يحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي ، قم بتدوير الخليط لتعليق الحويصلات. ثم صوتنة الخليط لمدة 20 دقيقة في الحمام ، صوتنة في درجة حرارة الغرفة. بعد الصوتنة ، قم بثق التعليق من خلال مرشح غشاء بولي كربونات 100 نانومتر.

مرر التعليق عبر مرشح البثق ما مجموعه 17 مرة. ثم قم بتخزين الحويصلات المبثوقة في قارورة زجاجية عند أربع درجات مئوية. أولا باستخدام حبات ثاني أكسيد السيليكون بقطر 700 نانومتر.

اصنع معلقا من 15 مليار حبة في 0.1 كلوريد الصوديوم المولاري. قم بتدوير التعليق ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 1700 Gs لمدة 20 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل عن طريق إعادة التركيب ، مع تعليق الخرزات في مليلتر آخر من محلول الملح وقم بتدويرها لأسفل لمدة 20 دقيقة أخرى.

ثم كرر العملية مرة ثالثة لتشكيل طبقات ثنائية الدهون المدعومة كرويا أو SSBs. امزج 25 ميكرولترا من تعليق حبة ثاني أكسيد السيليكون مع 200 ميكرولتر من تعليق الحويصلة من القسم السابق. دوامة الخليط واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة بعد ذلك ، والطرد المركزي للخليط على حرارة 1700 غرام لمدة 20 دقيقة.

تخلص من المادة الطافية. الحبيبات وردية اللون إلى الحويصلات الممزقة مع صف DPPE على الخرز. أعد تعليقه في 225 ميكرولتر من PBS عند PH 7.4.

كرر خطوات الدوران وتعليق Resus مرتين لإزالة الحويصلات غير الممزقة وإكمال إنشاء SSBs. قسم رقائق مصفوفات الآبار الصغيرة إلى قطع مستطيلة من أربعة إلى ستة مصفوفات لكل منها. بعد ذلك ، الدوامة ، تعليق SSLB من القسم السابق ونقل 10 ميكرولتر إلى كل مجموعة بئر صغيرة.

انتظر ساعة حتى تستقر SSBs لاحقا. اغسل رقائق المصفوفة باستخدام PBS برفق واغمر المصفوفة في PBS باستخدام انزلاق الممسحة على سطح الرقائق المغمورة خمس مرات. هذا يزيل SLPs غير داخل الآبار الصغيرة.

بعد ذلك ، أمسك كل شريحة صفيف بالملاقط وتخلص من PBS برفق. ثم انقله إلى حمام PBS جديد. يجب أن تظل الأسطح العلوية للرقائق مبللة.

قم بإزالة شريحة من الحمام وبعيدا. معظم PBS مع مسح المختبر. اترك ما يكفي من PBS للحفاظ على ترطيب المصفوفة.

أضف الآن 200 ميكرولتر من محلول BSA إلى المصفوفة لمنع الارتباط غير المحدد. اسمح للمصفوفة بالاحتضان لمدة ساعة. في صندوق مرطب لاحقا ، قم بإزالة BSA بماصة صغيرة وأضف 200 ميكرولتر من محلول توكسين الكوليرا.

ثم أعد المصفوفة إلى الغرفة المرطبة. انتظر ساعة أخرى ، ثم اغسل المصفوفة باستخدام PBS وتخلص من PBS الزائدة بمسحة حضن. ثم ضع شريحة المصفوفة على شريحة مجهرية قياسية وقم بإرفاق زلة غطاء مربعة مقاس 24 × 40 ملم بالمصفوفة واستمر في التصوير.

يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام وظائف تحليل الجسيمات الآلية للصورة. ثم لكل مصفوفة ، لخص متوسط شدة SSBs الفردية كرسوم بيانية. بعد استخدام الطرق الموضحة ، تظهر مساحة 100 ميكرون مربع على مصفوفة 936 SSBs.

بينما تم حساب بيانات الإشغال وتم إنشاء رسم بياني لشدة الفلورسنت SSLB بعد أسبوع في التخزين. تمت إعادة تحليل نفس المصفوفة بنفس الطريقة ، ولم يكن هناك تغيير في شدة الفلورسنت أو إشغال المصفوفة. كان الترسيب المتسلسل لمختلف SSBs بعلامات تعريف مختلفة ممكنا أيضا باستخدام الطرق الموضحة.

تم إيداع SSBs الثانية في واحد 10. تركيز أول SSBs المودعة. يتم عرض تراكب لكلتا العلامتين للتجربة.

تم تصنيع المصفوفات باستخدام SSBs بتركيزات مختلفة من GM واحد وتعرضت لتركيز ثابت من توكسين الكوليرا. تم إجراء المعكوس أيضا لتحديد ثابت تفكك التوازن. لجنرال موتورز واحد.

يمكن أيضا صنع مصفوفات ربط سموم الكوليرا من أغشية حيوية طبيعية ، مثل هذه المجموعة المصنوعة من جزيئات المايلين. تم تصنيفه بالفلورو المحبة للدهون أربعة FM 1 43. الطوافات الدهنية غنية بالكوليسترول والجانجليوزيدات مثل GM one.

وبالتالي ، فإن توكسين الكوليرا المترافق Alexa 4 88 يرتبط بقوة بالمصفوفات الدقيقة للطوافة الدهنية على النقيض من ذلك ، فإن عدن المجردة المصنفة بالفلورسنت لا ترتبط بهذه المصفوفات. تم عمل مصفوفة عن طريق توصيل طوافات المايلين والدهون إلى الآبار الصغيرة عبر شريحة ميكروفلويديك بقنوات 250 ميكرون. تم تصنيفه بمضاد لقليل التغصن IgM وتم تسمية كبريتيد S الموجود في المايلين ، لكن الطوافات الدهنية لم تكن كذلك.

ليس مرة واحدة يتم تحضير الخرز المطلي بالخرز الدهني. يمكن استخدام هذه التقنية لإعداد المصفوفات في ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، بعد إنشاء مصفوفات جسيمات الغشاء الطبيعي. يمكن استخدام طرق أخرى مثل البلازما السطحية والرنين للاستشعار الخالي من الملصقات للتفاعلات الجزيئية الحيوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مصفوفات الأغشية الحيوية باستخدام حبات مطلية بطبقة الصفراء الدهنية وجزيئات الغشاء الطبيعي.