A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تحديد مواد جديدة تعتمد على هلام السول (sol gel) لتصنيع المصفوفات الدقيقة واستخدامها في مقاييس إنزيمية ذات أحجام نانوية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحديد المواد التي تمتلك أوقات تصلب طويلة بما يكفي لتجنب التجلط في دبوس طباعة المصفوفة الدقيقة أثناء عملية الطباعة أولاً. وتتمثل الخطوة الثانية في تقييم المواد ذات أوقات التصلب الطويلة من حيث قدرتها على الطباعة كمصفوفات دقيقة، ومدى قابليتها للتكرار، ومقاومتها للتصدع، وجودة الالتصاق، وانفصال الطور غير المرغوب فيه، وفي النهاية مدى النشاط العالي للإنزيمات المحتجزة.

بعد ذلك، يتم طباعة الإنزيم المعني في شكل مصفوفة مجهرية باستخدام المواد المثلى، ثم يتم اختبار قدرته على استقبال محلول المقايسة وتوليد استجابة إنزيمية قابلة للقياس. وتتمثل الخطوة النهائية في تقييم المواد من حيث قدرتها على توفير مقايسات عالية التكرارية باستخدام الإنزيم المعني وتوليد بيانات كمية. وبناءً على ذلك، يتم اختيار المادة النهائية لتصنيع المصفوفة.

في نهاية المطاف، تُستخدم المصفوفات الدقيقة البروتينية المشتقة من هلام السول لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تقلل من نشاط الإنزيم. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل الفرز المعتمد على الأطباق، هي القدرة على فحص أعداد كبيرة من المواد بطريقة منهجية وسريعة جداً وباستخدام أحجام منخفضة من الكواشف. وبوجه عام، قد يواجه المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات نظراً لإمكانية تحول المواد إلى هلام داخل دبابيس الطباعة.

إذا لم يتم تنظيف هذه الأجزاء بشكل صحيح، فسيؤدي ذلك إلى وجود بقع مفقودة يمكن تفسيرها على أنها مواد غير قابلة للطباعة. للبدء، قم بتحضير المحاليل المضافة المتعددة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. يمكن تحضير العديد من المحاليل مسبقاً وتخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد أو أكثر في الظروف الصحيحة، ولكن يجب تحضير بعضها في يوم التجربة.

اخلط المناشير القائمة على سيليكات الصوديوم مباشرة قبل الاستخدام، مع الحرص على إبقائها مبردة على الثلج. يجب استخدام الـ SOS في غضون ساعة واحدة من إضافة الماء، لأن فترات الانتظار الأطول تؤدي إلى انخفاض وعدم اتساق أزمنة الـ DATION. بعد ذلك، قم بتحضير تركيبات متنوعة من المحاليل المنظمة، والبوليمرات الملحية، والـ organs lanes كما هو موجه في البروتوكول النصي المرفق، وذلك لتحديد التركيبات التي يمكن استخدامها كمواد قابلة للطباعة بأزمنة تمدد تزيد عن 2.5 hours.

بمجرد تحديد عدد من التركيبات، اضبط الرطوبة داخل غرفة الطباعة على 80 إلى 90%، حيث إن الرطوبة التي تقل عن 80% قد تؤدي إلى تبخر العينة وحدوث تضاربات في الطباعة نظراً لأحجام الترسيب الصغيرة في الطابعة. الآن وبعد الجاهزية، قم بترتيب أنماط المصفوفة المراد طباعتها باستخدام برنامج Chip Writer Pro. اضبط سرعة الحركة في اتجاه XY على 10 millimeters per second وسرعة اقتراب العينة في اتجاه Z على two millimeters per second مع زمن تحميل للعينة قدره 2.5 second باستخدام تركيبات الهلام التي تم تحديدها سابقاً.

قم بتحضير 25 µL من المواد الأساسية عن طريق دمج البوليمرات المقابلة، والأورجانولان، والمواد المضافة من الجزيئات الصغيرة التي تم تحديدها من خلال عملية الفحص المسبق. استخدم محاليل 50 mM بـ pH قدره 8.0 في آبار فردية من لوحة معايرة دقيقة ذات 384 بئرًا. ثم قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية لما يصل إلى أربعة دبابيس غمد مشقوقة بقطر 100 micron في ماء مقطر مزدوج.

بعد مرور 15 دقيقة، جففها تحت تيار من النيتروجين. بعد ذلك، استخدم منظف أنابيب لإزالة الرطوبة المتبقية من داخل حامل الدبوس، ثم ضع الدبوس بعناية في رأس الطباعة الخاص بروبوت طباعة الدبابيس التلامسية. قد يؤدي عدم إزالة الرطوبة المتبقية إلى إعاقة حركة الدبوس بحرية داخل الحامل، مما يتسبب في ظهور بقع مفقودة.

ثم أضف 25 µL من SA المعني إلى البئر مباشرة قبل عملية الطباعة. امزج المحلول باستخدام حركة السحب والدفع بالماصة، وكرر ذلك 50 مرة عند المزج بالماصة. قلل قدر الإمكان من كمية الهواء المدمجة في المحلول.

تمنع فقاعات الهواء التحميل الكامل للعينة داخل الدبوس. بعد ذلك، قم بتحميل الدبوس عن طريق خفضه داخل العينة. وبمجرد تحميل الدبابيس، ابدأ عملية الطباعة واطبع العينة على أحد سطحي الشريحة.

أوقف عملية الطباعة مؤقتاً قبل إضافة الملح إلى لوحة المصدر التالية. وفي أثناء إيقاف العملية، قم بإزالة دبوس الطباعة باستخدام مغناطيس، وضع منظف غلايات في رأس الطباعة لمنع تراكم الرطوبة فيه. ثم اشطف دبوس الطباعة بالماء المقطر المزدوج، وعرّضه للموجات فوق الصوتية في ماء مقطر مزدوج ونظيف لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، جفف دبوس الطباعة تحت تيار من النيتروجين ثم أعد الدبوس إلى رأس الطباعة. استمر في عمليات الخلط والطباعة والتنظيف لجميع العينات المتبقية في لوحة المصدر، حيث يمكن ترسيب ما يصل إلى 12,000 بقعة بقطر 100 microns على شريحة واحدة. بمجرد انتهاء الطباعة، اترك المصفوفة لتتعتق لمدة لا تقل عن 30 minutes وتصل إلى 24 hours داخل غرفة الطباعة عند رطوبة تتراوح بين 80 إلى 90%.

قم بتحضير 50 µL من الضابط الموجب قبيل الاستخدام مباشرة عن طريق دمج 25 µL من acetylcholine iodide بتركيز 1 mM، و0.14 µL من bodi pi, FIL cysteine بتركيز 5 mM، و25 mM من tris عند pH 7.0 مع 4% glycerol في بئر من لوح معايرة دقيق (microtiter plate) سعة 384 بئر، ثم قم بسحب المحلول ودفعه بالمصّة ببطء للمزج دون تكوين فقاعات. بعد ذلك، قم بتحضير الضوابط السالبة قبيل الاستخدام مباشرة عن طريق دمج 0.14 µL من boai PI FIL cysteine بتركيز 5 mM مع 49.86 µL من 25 mM triss عند pH 7.0 مع 4% glycerol في بئر آخر من لوح المعايرة الدقيقة سعة 384 بئر وامزجهما بلطف. قم بطباعة الضوابط على المصفوفات الدقيقة المتقادمة باستخدام نفس العمليات الموضحة في القسم السابق، ولكن بدلاً من الدبابيس ذات القطر 100 micron، استخدم دبابيس chief بقطر 235 microns.

يضمن ذلك تغطية المحاليل بالكامل للبقع التي تم ترسيبها مسبقاً. تُترك البقع لتتقادم في المصفوفات في رطوبة تتراوح بين 80 إلى 90% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بسبب التحلل المائي الذاتي للأستيل كولين. قد تؤدي فترات التحضين الأطول إلى ظهور نتائج إيجابية كاذبة نتيجة لزيادة نشاط الإنزيم.

تأكد من تشغيل جهاز التصوير alpha innotech novo array وتجهيزه بمرشح إثارة 478 ± 17 نانومتر ومرشح انبعاث 538 ± 21 نانومتر لقياس المصفوفات المجهرية لإنزيم acetylcholine esterase. ثم ضع الشريحة في حامل الشرائح بحيث تكون البقع متجهة للأعلى. اضبط عدد أقسام المعاينة بحيث يتم معاينة قسم واحد على الأقل من كل جانب من جوانب شريحة المجهر بدقة لا تقل عن 4 ميكرومتر باستخدام التعريض التلقائي.

بمجرد التحقق من أن المعلمات مقبولة، قم بالتقاط صورة للشريحة وحفظها كملف TIFF. بعد ذلك، افتح صورة الشريحة التي تم الحصول عليها في برنامج image J 64. انقر فوق أداة التحديد البيضاوي (Oval Selection Tool) وحدد كل بقعة.

حدد منطقة أكبر قليلاً من البقعة المرصودة، واحرص على استخدام حجم ثابت بين البقع لتقليل الذاتية في برنامج Image J. ثم قم بقياس شدة الإشارة لكل بقعة باستخدام خيار القياس (measure) الموجود تحت علامة تبويب التحليل (analyze). احسب متوسط الشدة لـ 25 بقعة مشابهة من الضابط الموجب، واقسم الناتج على متوسط الشدة لـ 25 بقعة مشابهة من الضابط السالب للحصول على نسب الضابط الموجب إلى الضابط السالب لكل تركيب مادي على حدة.

يظهر هنا مثال للنطاق الديناميكي للمصفوفات الدقيقة الناتجة التي تم تحضيرها باستخدام هذه الطرق. وقد أدت الضوابط المرتفعة إلى ظهور مناطق خضراء ساطعة، بينما أدت الضوابط المنخفضة إلى ظهور بقع أكثر خفوتاً. وتظهر الشدة المقاسة بواسطة Image J 64 أن متوسط الضوابط المرتفعة يبلغ حوالي 22,000 وحدة فلورية نسبية، بينما بلغ متوسط الضوابط المنخفضة قرابة 8,000.

تمثل الخطوط المنقطة ثلاثة انحرافات معيارية عن المتوسط. تظهر هنا أمثلة للمصفوفات الدقيقة لفحص مصفوفة تشريفية لنظائر اصطناعية من قلويدات ameral sier المحددة كمركب واحد ومركب اثنين. يمثل كلا المحورين النسبة المئوية للإنزيم كما تم تحديدها بواسطة الإشارة الفلورية.

يمثل تقارب النقاط من الخط القطري في العينات المكررة درجة عالية من تكرارية المقايسة. وتظهر هنا مخططات IC 50 لمثبطين محتملين مختلفين؛ حيث أدى المركب الأول إلى مستوى IC 50 قدره 16 micromolar، بينما كان IC 50 للمركب الثاني 21 micromolar. كما تُعرض البقع التمثيلية أعلاه لتوضيح الاختلافات في الإشارة بما يتناسب مع تركيزات المثبط.

تم طباعة المصفوفة الموضحة هنا باستخدام أربعة كينازات مختلفة، وهي P 38 map kinase وEGFR وGSK، وتمت الطباعة فوقها باستخدام محلول منظم وحده، ومحلول منظم يحتوي على ATP، ومحلول منظم يحتوي على ATP وstaurosporin وهو مثبط لنشاط الإنزيم. وتظهر النتائج تأثيراً ملحوظاً لمثبط الكيناز staurosporin بناءً على شدة الفلورة الناتجة كما هو موضح هنا. وكان أكبر فرق لوحظ عند تركيز staurosporin المستخدم هنا هو في بقع P 38.

تظهر هنا بقع تمثيلية لمصفوفة ميكرو مصفوفة P 30 8:00 AM BP، والتي تم وضع بقع فوقها بتركيزات متفاوتة من stor sporin. وكما هو موضح، تم تحديد قيمة IC 50 لهذا الجزيء لتكون 1 µM، وهي موضحة في الرسم البياني على اليمين. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون ساعات قليلة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وفقاً لهذا الإجراء.

يمكن أيضاً إجراء طرق أخرى مثل المقايسات المناعية أو مقايسات التفاعل البروتيني للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتشخيص أو اكتشاف الجزيئات الصغيرة.