A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المواد الجديدة القائمة على هلام الروح لتصنيع المصفوفات الدقيقة واستخدامها في فحوصات إنزيم حجم النانو. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد المواد التي لها أوقات طويلة بما فيه الكفاية لتجنب التبلور في دبوس طباعة المصفوفات الدقيقة أثناء عملية الطباعة. تتمثل الخطوة الثانية في تقييم المواد ذات الأوقات الطويلة لقدرتها على الطباعة كمصفوفات دقيقة ، ومقاومة التكسير ، وجودة الالتصاق ، وفصل الطور غير المرغوب فيه ، والنشاط العالي في النهاية للإنزيمات المحبوسة.

بعد ذلك ، تتم طباعة الإنزيم محل الاهتمام كمصفوفة دقيقة باستخدام المواد المثلى ويتم اختبار قدرته على تحديد محلول الفحص وتوليد استجابة إنزيمية قابلة للقياس. تتمثل الخطوة الأخيرة في تقييم المواد لقدرتها على توفير فحوصات قابلة للتكرار بدرجة عالية باستخدام الإنزيم محل الاهتمام وتوليد البيانات الكمية. ثم يتم اختيار المادة النهائية لتصنيع المصفوفة.

في النهاية ، يتم استخدام المصفوفات الدقيقة للبروتين المشتق من هلام الروح لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تقلل من نشاط الإنزيم. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الطرق الحالية مثل الفحص القائم على الألواح ، هي أنه يمكنك فحص أعداد كبيرة من المواد بطريقة منهجية بسرعة كبيرة باستخدام كميات منخفضة من الكواشف. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنه من الممكن وجود مواد هلامية داخل دبابيس الطباعة.

إذا تم تنظيفها بعد ذلك بشكل صحيح ، فسيؤدي ذلك إلى فقدان البقع التي يمكن تفسيرها على أنها مواد غير قابلة للطباعة. للبدء ، قم بإعداد العديد من الحلول المضافة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. يمكن إعداد العديد من المحاليل مسبقا وتخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد أو أكثر في ظل الظروف الصحيحة ، ولكن يجب صنع بعضها في يوم التجربة.

امزج المناشير القائمة على سيليكات الصوديوم مباشرة قبل الاستخدام ، وتأكد من إبقائها على الثلج. يجب استخدام SOS في غضون ساعة واحدة من إضافة الماء لأن فترات الانتظار الأطول تؤدي إلى تقليل أوقات التوقف وعدم اتساقها. بعد ذلك ، قم بإعداد مجموعات مختلفة من المخازن المؤقتة ، وبوليمرات السالان ، وممرات الأعضاء وفقا للتوجيهات الواردة في بروتوكول النص المصاحب من أجل تحديد المجموعات التي يمكن استخدامها كمواد قابلة للطباعة بأوقات تمدد أكبر من 2.5 ساعة.

بمجرد تحديد عدد من التركيبات، اضبط الرطوبة داخل غرفة الطباعة على 80 إلى 90٪ من الرطوبة أقل من 80٪ قد تؤدي إلى تبخر العينة وعدم الاتساق في الطباعة بسبب أحجام الترسيب الصغيرة مع الطابعة. جاهز الآن ، قم بترتيب أنماط المصفوفة المراد طباعتها باستخدام برنامج Chip Writer Pro. اضبط السفر في اتجاه XY على 10 ملليمترات في الثانية وسرعة اقتراب العينة في الاتجاه Z إلى ملليمترين في الثانية مع وقت تحميل العينة البالغ 2.5 ثانية باستخدام مجموعات هلام المنشار المحددة سابقا.

قم بإعداد 25 ميكرولترا من المواد الأساسية من خلال الجمع بين البوليمرات المقابلة والممرات العضوية وإضافات الجزيئات الصغيرة التي تم تحديدها من خلال عملية الفحص المسبق. باستخدام أكوام 50 مللي مولار بدرجة حموضة 8.0 في آبار فردية من صفيحة ميكروتيتر 384 بئر. ثم صوتنة ما يصل إلى أربعة دبابيس غمد مشقوقة بقطر 100 ميكرون في ماء مقطر مزدوج.

بعد 15 دقيقة ، جربهم تحت تيار من النيتروجين. بعد ذلك ، استخدم منظف الأنابيب لإزالة الرطوبة المتبقية من داخل حامل الدبوس ووضع الدبوس بعناية في رأس الطباعة لروبوت طباعة دبوس التلامس. قد يؤدي عدم إزالة الرطوبة المتبقية إلى إعاقة الدبوس من التحرك بحرية مع الحامل مما يؤدي إلى فقدان البقع.

ثم أضف 25 ميكرولترا من SA المعني إلى البئر قبل الطباعة مباشرة. امزج المحلول باستخدام حركة سحب لأعلى ولأسفل تكرر 50 مرة عند الخلط بواسطة الماصة. قلل من كمية الهواء المدمجة في المحلول.

تمنع فقاعات الهواء التحميل الكامل للعينة داخل الدبوس. بعد ذلك ، قم بتحميل الدبوس عن طريق خفضه في العينة. بمجرد تحميل المسامير ، ابدأ عملية الطباعة واطبع العينة على سطح شريحة واحد.

أوقف عملية الطباعة مؤقتا قبل إضافة الملح إلى لوحة المصدر اللاحقة. حسنا ، مع إيقاف العملية مؤقتا ، قم بإزالة دبوس الطباعة باستخدام مغناطيس وضع منظف الأنابيب في رأس الطباعة لمنع تراكم الرطوبة في رأس الطباعة. ثم اشطف دبوس الطباعة بالماء المقطر المزدوج وقم بصوتنه في ماء مقطر مزدوج نظيف لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، جفف دبوس الطباعة تحت تيار من النيتروجين ثم ضع الدبوس مرة أخرى في رأس الطباعة. استمر في الخلط والطباعة والتنظيف لجميع العينات المتبقية داخل لوحة المصدر حتى 12،000 بقعة ، ويمكن ترسيب قطرها 100 ميكرون على شريحة واحدة. بمجرد الانتهاء من الطباعة، قم بتقادم المصفوفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة وما يصل إلى 24 ساعة داخل غرفة الطباعة عند رطوبة تتراوح من 80 إلى 90٪.

قم بإعداد 50 ميكرولترا من التحكم الإيجابي قبل الاستخدام مباشرة عن طريق الجمع بين 25 ميكرولترا من مليمولات واحدة ، ويوديد أستيل كولين ، و 0.14 ميكرولتر من خمسة ملليمولار بودي باي ، و FIL cysteine ، و 25 ملليمولار تريس عند درجة الحموضة 7.0 مع 4٪ جلسرين في بئر ماصة صفيحة ميكروتيتر 384 Well ، قم بتجميع المحلول لأعلى ولأسفل ببطء للخلط دون تكوين فقاعات. بعد ذلك ، قم بإعداد عناصر التحكم السلبية قبل الاستخدام مباشرة عن طريق الجمع بين 0.14 ميكرولتر من خمسة ملليمولار boai PI FIL cysteine إلى 49.86 ميكرولتر من 25 ملليمولار تريس عند درجة الحموضة 7.0 مع 4٪ جلسرين في بئر آخر من لوحة عيار دقيقة 384 جيدا واخلطها برفق فوق طباعة عناصر التحكم على المصفوفات الدقيقة القديمة باستخدام نفس العمليات الموضحة في القسم السابق. ومع ذلك ، بدلا من المسامير التي يبلغ قطرها 100 ميكرون ، قمت بشق دبابيس رئيسية بقطر 235 ميكرون.

هذا يضمن أن الحلول تغطي البقع المودعة مسبقا بالكامل. تعمر البقع المصفوفات في رطوبة تتراوح من 80 إلى 90٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بسبب التحلل المائي التلقائي للأستيل. قد تؤدي أوقات الحضانة الأطول إلى إيجابيات كاذبة بسبب نشاط الإنزيم المعزز.

تأكد من تشغيل جهاز تصوير مصفوفة alpha innotech novo وتجهيزه بإثارة 478 زائد أو ناقص 17 نانومتر ومرشح انبعاث 538 زائد أو ناقص 21 نانومتر لقياس المصفوفات الدقيقة للأستيل كولين إستراز. ثم ضع الشريحة في حامل الشريحة بحيث تكون البقع متجهة لأعلى. قم بتعيين عدد أقسام المعاينة بحيث تتم معاينة مقطع واحد على الأقل على جانبي شريحة المجهر بدقة لا تقل عن أربعة ميكرومترات باستخدام التعريض الضوئي التلقائي.

بمجرد العثور على المعلمات مقبولة ، احصل على صورة شريحة واحفظها كملف TIFF. بعد ذلك ، افتح صورة الشريحة المكتسبة في الصورة J 64. انقر على أداة التحديد البيضاوي وحدد كل نقطة.

حدد منطقة أكبر قليلا من البقعة المرصودة ، وتأكد من استخدام حجم ثابت بين النقاط لتقليل ذاتية الصورة J.ثم قم بقياس شدة الإشارة لكل بقعة باستخدام خيار القياس. ضمن علامة التبويب تحليل. متوسط الشدة من 25 نقطة تحكم إيجابية مماثلة والقسمة على متوسط شدة 25 نقطة تحكم سلبية مماثلة للحصول على نسب تحكم إيجابية إلى نسب تحكم سلبية لتركيبات المواد الفردية.

يظهر هنا مثال على النطاق الديناميكي للمصفوفات الدقيقة الناتجة المعدة باستخدام هذه الطرق. أدت الضوابط العالية إلى مناطق خضراء زاهية ، بينما أدت الضوابط المنخفضة إلى ظهور بقع باهتة. تظهر الكثافة كما تم قياسها بواسطة الصورة J 64 أن الضوابط العالية تصل إلى متوسط حوالي 22،000 وحدة فلورسنت نسبية ، وبلغ متوسط أدوات التحكم المنخفضة ما يقرب من 8،000.

تمثل الخطوط المنقطة ثلاثة انحرافات معيارية عن المتوسط. فيما يلي أمثلة على المصفوفات الدقيقة لفحص مصفوفة الشرف لنظائرها الاصطناعية من قلويدات الميرال التي تم تحديدها على أنها المركب الأول والمركب الثاني. يمثل كلا المحورين النسبة المئوية للإنزيم كما تحدده إشارة الفلورسنت.

في تكرار ، يمثل قرب النقاط من القطر قابلية عالية للتكرار للمقايس. يتم عرض مخططات IC 50 لاثنين من المثبطات المحتملة المختلفة هنا. نتج عن المركب الأول مستوى IC 50 من 16 ميكرومولار ، في حين أن IC 50 للمركب الثاني كان 21 نقطة تمثيلية ميكرومولار معروضة أعلاه لتوضيح الاختلافات في الإشارة التي تتناسب مع تركيزات المثبطات.

تمت طباعة المصفوفة الموضحة هنا بأربعة كينازات مختلفة ، P 38 map kinase و EGFR و GSK ، وتم طباعتها مع المخزن المؤقت وحده الذي يحتوي على A TP والمخزن المؤقت الذي يحتوي على A TP و starro sporin مثبط لنشاط الإنزيم. تظهر النتائج تأثيرا كبيرا من مثبط كيناز ستارو سبورين بناء على شدة التألق الناتجة كما هو موضح هنا. كان الاختلاف الأكبر الذي شوهد عند تركيز سبورين المخزون المستخدم هنا من نقاط P 38.

هنا ، يتم عرض البقع التمثيلية لمصفوفة دقيقة P 30 8:00 AM BP ، والتي تم رصدها أكثر من اللازم بتركيزات متفاوتة من سبورين الستور. كما هو موضح ، تم تحديد IC 50 من هذا الجزيء على أنه ميكرومولار واحد ويظهر في الرسم البياني على اليمين بمجرد إتقانه. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعات قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء.

يمكن أيضا إجراء طرق أخرى مثل المقايسات المناعية أو فحوصات تفاعل البروتين للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتشخيص أو اكتشاف الجزيئات الصغيرة.