تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار
أغسطس 9, 2014
الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي.
الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم تكوين جزء النيفرون ووظائفه في كلية أسماك الحمار الوحشي البالغة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن الدكسترين المسمى بالفلورسنت أولا في عش يربط أسماك الحمار الوحشي. الخطوة الثانية هي إزالة الكلى وإصلاحها لإعداد الأنسجة لطرق وضع العلامات اللاحقة.
بعد ذلك ، يتم تبييض الكلى لإزالة التصبغ ثم تلطيخها بعلامات الفلورسنت على أجزاء النيفرون المرغوبة. يتم الحصول على النتائج باستخدام التألق المناعي والفحص المجهري و / أو التصوير الميداني الساطع الذي يتيح تصور تشريح الكلى بناء على البقعة أو البقع المحددة. يمكن أن تساعد طرق وضع العلامات التالية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكلى فيما يتعلق بتشريح الأعضاء ويمكن استخدامها لدراسة تكوين النيفرون وتقييم وظائف الكلى قبل وبعد حدث الإصابة.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنيات إلى دراسة التشوهات الجينية في تكوين الكلى البالغة ويمكن أيضا تطبيقها لتقييم الحالة الكلوية أثناء نمذجة الأمراض المزمنة. للبدء صب المحلول من سمكة مخدرة ووضع بعناية على الجانب البطني العفن الإسفنج الرطب. بعد ذلك ، املأ حقنة الأنسولين ب 20 ميكرولترا من محلول مخزون الدكسترين المذاب.
ضع الإبرة بحيث يحدث الإدخال بزاوية ضحلة عند خط الوسط البطني للبطن. لتجنب حقن الأعضاء قليلا ، ارفع الإبرة بعد الحقن مباشرة لرفع جدار الجسم وخلق مساحة لحقن المحلول. بعد الحقن ، أعد السمكة برفق إلى الخزان للتعافي من التخدير.
للبدء ، قم بالتخلص من أي محلول إضافي من سمكة مخدرة وضعها على منديل أو منشفة ورقية. بعد إزالة الرأس والأعضاء الداخلية ، استخدم إبر تشريح فائقة الدقة لفتح جدران الجسم. حدد موقع عضو الكلى الملتصق بالجدار الظهري للحيوان.
استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية عن الجدار الظهري. ضع الكلية برفق في قارورة زجاجية سعة خمسة ملليلتر تحتوي على XPBS واحد واغسلها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. قم بإزالة الكلية بماصة نقل وضعها على شريحة زجاجية نظيفة مع قطرة إلى قطرتين من XPBS واحد.
استخدم ملقطا دقيقا لتسطيح الكلى على الشريحة ، مع التأكد من عدم تجعد أي نسيج أو انقلبت على نفسها. يمكن استخدام أداة سلك التنغستن لعمل شقوق صغيرة في النسيج الضام لتسهيل وضع الكلى بشكل مسطح. بعد ذلك ، ضع قطعا صغيرة من طين النمذجة على كل ركن من زلة غطاء زجاجي مقاس 18 × 18 ملم.
اضبط زلة الغطاء ببطء على الكلى ، مع الحفاظ على زاوية طفيفة. لتقليل فقاعات الهواء المحبوسة، أضف قطرة إضافية من XPBS لملء الفراغ بين انزلاق الغطاء والانزلاق إذا لزم الأمر. يتم القتل الرحيم لمجموعة منفصلة من أسماك الزرد ونقعها في مثبت طوال الليل.
عندما تصبح جاهزا ، استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية بعناية عن جدار الجسم الظهري ووضع العضو في قارورة زجاجية. اغسل الكلية المقطعة ثلاث مرات بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من XPBS واحد مع 0.05٪ من المراهقين لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PBS وشطف الكلى بثلاثة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة.
بعد هذا الوقت ، استبدل المحلول بثلاثة ملليلتر من 30٪ سكروز واحفظه طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. قم بإزالة المحلول وغسل الكلى مرتين قبل إضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من محلول التبييض. لإزالة تصبغ الخلايا الصباغية الموجود على عضو الكلى ، ضع القارورة الزجاجية على دوار وراقب بعناية اختفاء التصبغ.
يستغرقإزالة التصبغ عادة حوالي 20 دقيقة ، ولكن في بعض الأحيان قد يستغرق ما يصل إلى 60 دقيقة. إذا ترك محلول التبييض لفترة طويلة جدا ، فقد يحدث التفكك ، وبالتالي ينصح بمراقبة العينة كل 10 إلى 15 دقيقة للتحقق من سلامتها عند إزالة التصبغ من غسل الكلى مرتين واحتضانه بمحلول 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول 4٪ PFA واغسل الكلى ثلاث مرات بعد الغسيل الأخير بمعدل ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من محلول الحجب واحتضان الكلى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
عند اكتمال الحجب ، انتقل مباشرة إلى بروتوكول التلوين المحدد. قم بإزالة محلول الانسداد واغسل الكلى ثلاث مرات قبل ترك الكلى تنقع في XPBS لمدة 10 دقائق على الأقل. خلال هذا الوقت ، انقل الكلية إلى طبق ثقافة 12 بئر أو 24 بئر.
استبدل XPBS بمحلول ركيزة الفوسفاتيز القلوي الكافي لتغطية العينة ووضع العينة على دوار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا الوقت ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الكلى بمحلول عازلة للغسيل بالفوسفاتيز القلوي. اشطف الكلى بثلاثة تغييرات من محلول الغسيل المؤقت على مدار 10 إلى 15 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الغسيل العازل وتركيب الكلى على كوب نظيف. حرك وسط تركيب الفوسفاتيز المضمن في مجموعة الملصقات. تصور الكلى الملطخة بالفوسفاتيز القلوي باستخدام مجهر استريو أو مجهر مركب مع مجموعة مرشحات دبي.
أولا ، قم بإعداد حل DBA يعمل بسعة 200 ميكرولتر عن طريق تخفيف DBA في XPBS واحد. استبدل محلول PBS ب 200 ميكرولتر من محلول DBA وضع العينة على محور دوار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا الوقت ، قم بإزالة محلول DBA واغسل الكلى ثلاث مرات بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من XPBS لمدة خمس دقائق لكل منهما.
قم بإزالة XPBS وقم بتركيب الكلية على شريحة زجاجية نظيفة. كما هو موضح سابقا ، تخيل الأجزاء البعيدة الملطخة ب DBA من الكلى باستخدام مرشح Trixie أو Texas الأحمر القياسي المثبت على مجهر ستيريو فلوري أو مجهر مركب. في هذه الصورة الساطعة لكلية غير مبيضة ، يتوافق التصبغ الأسود مع السكان المتناثرين من الخلايا الصباغية.
هنا يتم تصور قطاعات التخلصات من الكليفون بعد ثلاثة أيام من حقن الدكسترين. يحتوي الجزء الداخلي على صورة لنيفرون واحد مصاب بالخلايا الصباغية. تظهر هذه الصورة كلية بالغة بعد إزالة تصبغ الخلايا الصباغية.
تصور هذه الصور التمثيلية اختلافات مورفولوجية طفيفة بين أجزاء معاهدة التعاون بشأن البراءات ، في حين أن العديد من PCTs للنفرون ملفوفة بإحكام. تحتوي النيفرون الأخرى على مناطق معاهدة التعاون بشأن البراءات التي تحتوي على الحد الأدنى من التفاف دكسكترين الشلال الأزرق ، ولوسيفر الأصفر ، ودكسترين فلورو روبي ، وكلها تصنف بشكل تفضيلي شرائح معاهدة التعاون بشأن البراءات في النيفرون الكلوي ، ويظهر كل من الدكسترين Cascade Blue و Lucifer Yellow بعض الملصقات غير المحددة مع خلفية أعلى بكثير لوحظت في الكلى المعالجة باللون الأصفر لوسيفر. في المقابل ، أظهر دكسترين فلورو روبي خلفية منخفضة بشكل كبير مع وضع العلامات المكثفة على معاهدة التعاون بشأن البراءات.
تظهر الكلى البالغة الملطخة بالرغبة في اكتشاف علامة محددة من نوع الخلية الناقل لمعاهدة التعاون بشأن البراءات خاصية نمط التعبير لامتصاص الدكسترين مع توزيع مختلف مجالات معاهدة التعاون بشأن البراءات الملفوفة بإحكام ، بالإضافة إلى امتدادات أكثر إطالة لمعاهدة التعاون بشأن البراءات تظهر قطرا عريضا ثابتا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية شرائح النيفرون بنجاح داخل كلية الزرد البالغة ، مثل النبيبات القريبة مع الفوسفاتيز القلوي والنبيبات البعيدة الطبية مع DBA. لا تنس أن العمل مع 4٪ بارالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء المعطف والقفازات والنظارات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتقييم تكوين ووظائف قطاعات الكبيبي في كلية سمك الزرد البالغ، وهو نموذج قيم لدراسات الكلى. تسهل المنهجيات الموصوفة تقييم بنية الكبيبي وإعادة الامتصاص الكلوي، مما يسهم في البحث عن تجديد الكلى والأمراض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- طب الكلى
- الطب التجديدي
- علم الأحياء المقارن
الخلفية
- سمك الزرد هو كائن حي نموذجي لدراسة وظيفة الكلى وتجديدها.
- فهم بنية الكبيبي أمر بالغ الأهمية لأبحاث أمراض الكلى.
- تقنيات الوسم الفلوري تحسن من تصور تشريح الكلى.
- تمتد آثار البحث إلى التشوهات الوراثية ونمذجة الأمراض المزمنة.
غرض الدراسة
- لتقييم تكوين قطاعات الكبيبي في كلى سمك الزرد.
- لتقييم الوظيفة الكلوية قبل وبعد الإصابة.
- لتطوير منهجيات قابلة للتطبيق في أبحاث الكلى.
الطرق المستخدمة
- حقن الديكسترين المسمى بفلورسنت في سمك الزرد.
- تشريح وتثبيت الكلية لتحضير الأنسجة.
- إزالة التصبغ وتلطيخ قطاعات الكبيبي.
- التصور باستخدام تقنيات المناعة الفلورية والمجهر.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لقطاعات الكبيبي بعد التلطيخ.
- تسمح التقنيات بتقييم تشريحي مفصل للكلى.
- تساهم النتائج في فهم تشريح ووظيفة الكلى.
- يمكن تكييف المنهجيات لتطبيقات متنوعة في أبحاث الكلى.
الاستنتاجات
- يعد نموذج كلى سمك الزرد فعالاً لدراسات الكبيبي.
- توفر تقنيات الوسم الفلوري رؤى حول وظيفة الكلى.
- تشير نتائج البحث إلى آثار على أمراض الكلى وتجديدها.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding nephron regeneration mechanisms in zebrafish provides predictive value for identifying compounds that modulate renal repair pathways. This model supports target validation by enabling functional assessment of nephron segment integrity before and after injury. The protocol facilitates mechanistic de-risking in early discovery by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable renal phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to renal regeneration pathways through segment-specific labeling.
- Operational Value: Provides reproducible readouts of nephron epithelial integrity and tubular function in adult zebrafish.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that promote true regeneration versus transient repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for proximal and distal tubule segments to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining workflows for high-content imaging platforms.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats for dose-response screening in renal injury models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage nephron labeling to preclinical evaluation of renal recovery in injury paradigms.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural nephron changes with functional dextrin clearance as a translational readout.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying nephron segment-specific damage and regeneration kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing functional renal phenotyping capabilities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of renal regeneration mechanisms via visualization of nephron segment composition.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized kidney preparations with segment-specific fluorescent outputs for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of dextrin uptake and segment intensity across conditions to assess renal functionality.
- Translational Research: Connects structural nephron assessment to functional recovery metrics in chronic disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal renal phenotyping across genetic and pharmacological injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in renal target validation through direct visualization of nephron segment integrity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, bleaching, and multi-step staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of nephrotoxic liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying regenerative capacity in preclinical renal models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Dependent on dextrin labeling reagents, bleaching solutions, and immunofluorescence infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent kidney dissection and mounting procedures.
- Adaptation considerations include species-specific pigmentation and nephron architecture in non-zebrafish models.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential dextrin efflux affecting longitudinal studies.
