تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين تحليل الفاصل الزمني للعمليات التنموية المتنوعة باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت مع استراتيجيات بسيطة لإعادة التنظيم بعد الانجراف في أي اتجاه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي لأنها تسمح بالملاحظة المباشرة للأنسجة وتطور الأعضاء في الأجنة الحية على مدى عدة ساعات. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها ميسورة التكلفة وسهلة الاستخدام بديلا للتقنيات الأكثر تعقيدا المستخدمة عادة للتسجيل بمرور الوقت للأنسجة والأعضاء النامية ، مثل المسح بالليزر أو الفحص المجهري المضاء.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التغيرات المكانية والزمانية التي تحدث أثناء تطور جنين السمك واليرقات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا للتحقيق في عمليات النمو المبكرة والكائنات الحية النموذجية الأخرى. علاوة على ذلك ، من المناسب مراقبة العمليات الديناميكية في الكائنات الحية البالغة ، مثل التئام الجذور وتجديدها. أثناء التحضير ، حدد الأسماك البالغة عالية التكاثر من خط التعبير عن GFP المعدل وراثيا.

بعد ظهر اليوم قبل الحقن الدقيق للنبات ، قم بإعداد خمسة أزواج من الأسماك التناسلية من الذكور والإناث في خمس حاويات تكاثر. في الحاويات ، احتفظ بالذكر والأنثى مفصولين عن طريق منخل قابل للإزالة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، بعد إضاءة الأنوار مباشرة ، ضع ذكرا وأنثى معا فوق الغربال ، مما يمنعهما من أكل بيضهما.

الآن ، راقب الأسماك أثناء تفريخها. بمجرد أن ينتج الزوج حوالي 50 بيضة ، افصلهما. بعد ذلك ، انقل البويضات باستخدام ماصة باستور إلى طبق بيتري مملوء بماء الجنين للجولة الأولى من الحقن.

كرر هذه العملية لكل زوج متزاوج. إذا كانت هناك حاجة إلى بيض إضافي ، فيمكن جمع نفس أزواج التزاوج معا وفصلها عدة مرات. بالنسبة للحقن الدقيق ، يتم التحضير المتقدم للأطباق وإبر الحقن بطريقة قياسية إلى حد ما.

يمكن العثور على التفاصيل في بروتوكول النص. ابدأ بتحميل إبرة حقن معدة. باستخدام طرف اللودر الصغير ، قم بإعادة ملء الإبرة بميكرولتر من محلول عمل MO ، ثم قم بتوصيل الإبرة في مناور دقيق.

ثم يمكن فتح طرف الإبرة. أثناء مشاهدته بمجهر التشريح ، استخدم الملقط لفتح الطرف ، أو دفع الطرف على سطح صلب. بعد ذلك ، قم بمعايرة حجم الحقن عن طريق حقن محلول MO في قطرة من الزيت المعدني على graticule.

اضبط الحقن لعمل قطرات 75 ميكرون والتي تتوافق مع حوالي 200 بيكوليتر من المحلول. بعد ذلك ، قم بإعداد الأجنة المراد حقنها. رتب ما يقرب من 21 أجنة في مرحلة الخلية على طول أخدود طبق الحقن الدقيق مع توجيه القطب النباتي نحو نهج إبرة الحقن الدقيقة ، والتي تكون بزاوية 45 درجة من الأخدود.

الآن ، حقن الأجنة. باستخدام الإبرة ، قم بثقب المشيمة وصفار البيض ، ثم قم بحقن محلول مورفولينو المحمل في صفار البيض. يعمل هذا مع الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة أو الخليتين.

بعد حقن جميع الأجنة ، استخدم باستور واسع التجويف لجمعها. انقل الأجنة المحقونة إلى أطباق بتري مملوءة بماء الجنين ، واحتضانها عند 28.5 درجة مئوية. في وقت لاحق من بعد الظهر ، قم بسحب الأجنة الميتة واستبدال ماء الجنين.

في صباح اليوم التالي ، بعد أن تمر الأجنة بالمعدة ، تمنع مياهها عن طريق استبدال مياهها بماء جنين يحتوي على كمية ضئيلة من PTU. كن حذرا ، سوف تعطل PTU التطور السليم قبل المعدة في وقت لاحق ، في مرحلة النمو المرغوبة ، قم بإزالة الأجنة بملاقط حادة.

باستخدام المجهر ، أمسك المشيمة بزوج واحد من الملقط ، وحاول الإمساك بالجانب الآخر من المشيمة بزوج ثان من الملقط. ثم اسحب الملقط بعناية دون تعطيل الجنين. بعد ذلك ، قم بتخدير الأجنة بالتريكايين ، واستمر في تضمين الأجنة والأغاروز على شبكة نقل 15 ميكرون موضوعة في طبق صغير ذو قاع زجاجي.

بعد ذلك ، قم بتحميل مليلتر واحد من أغاليز الذائب في أنابيب تفاعل 1.5 ملليلتر. ضع الأنابيب في كتل حرارية مضبوطة على 36 درجة مئوية ، وانتظر حتى تبرد. ثم ، باستخدام ماصة واسعة التجويف ، انقل الجنين إلى الطبق الصغير.

اسحب ماء الجنين الزائد وقم بتراكب الجنين بالأغروز. بينما لا يزال الاغاروز سائلا ، استخدم طرفين صغيرين من الماصة لتوجيه الأجنة. ضع الهيكل محل الاهتمام ، في هذه الحالة ، الرؤى ، في أقرب وقت ممكن من القاع الزجاجي ، وعلى مقربة من الشبكة.

يجب ألا تراكب الشبكة هيكل الاهتمام. من المفيد تضمين ما يصل إلى أربعة أجنة في أطباق صغيرة مختلفة ، والتخطيط لتصوير أفضلها. يحتاج التضمين الصحيح إلى بعض الممارسة.

بينما لا يزال الاغاروز سائلا ، يجب توجيه الجنين في الموضع المطلوب. إذا كان القصبة قريبا من قاع الزجاج ، وعلى مسافة مناسبة من شبكة النقل. تحقق من الاغاروز بشكل روتيني.

بمجرد أن يصبح من الصعب إمساك الأجنة بما يكفي ، اتركه يستقر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى. بعد ذلك ، قم بتراكب الجنين المدمج بماء الجنين الذي يحتوي على كميات ضئيلة من PTU و tricaine. صب أو سحب ماء الجنين الزائد وقفل الغطاء لمنع التبخر.

يجب ألا تحتوي النتيجة على أي فقاعات هواء. يمكن الآن تصوير الجنين مع مواجهة القاع الزجاجي للعدسة الشيئية. باستخدام التحضير لعمل صور فاصلة ، على سبيل المثال ، عن طريق التقاط صور Z-stack بشكل دوري على مدار عدة ساعات ، من الضروري تصحيح الانجراف البؤري.

إذا أمكن ، قم بتطبيق استراتيجية التركيز البؤري التلقائي. قم بتبديل خيار التركيز التلقائي في عنصر التحكم في البرنامج. بالنسبة للقناة المرجعية، اختر قناة المجال الساطع للضوء المرسل لتقليل سمية الصورة.

من الضروري أيضا اختيار نطاق بحث كبير بما فيه الكفاية يعتمد على العينة حتى يعمل التركيز التلقائي بشكل صحيح. قبل جمع الصور ، ضع نقطة معينة من الشبكة المطبوعة بالقرب من بنية الاهتمام في الشعيرات المتقاطعة للبرنامج ، ثم احفظ هذا الموضع باستخدام لقطة شاشة. بعد ذلك، قبل انتهاء كل فاصل زمني للتصوير مباشرة، ارجع إلى لقطة الشاشة وأعد ضبط موضع المرحلة والتركيز البؤري إذا لم يكن التركيز البؤري التلقائي قيد الاستخدام.

تم استخدام الطريقة المقدمة لتحليل نمو الكلى في الأجنة المتحولة WT1A لخط أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا. خلال الداء الكلوي المبكر ، اختار هذا الخط التألق الأخضر في الأديم المتوسط الوسيط حيث تنشأ أسلاف الكلى ، وبعد ذلك أثناء التطور في الأنابيب المكونة والنيفرون البدائية. كشف التصوير بفاصل زمني عن تكوين الكلية الطبيعي في الأجنة المحقونة مورفولينو للتحكم

بعد 20 ساعة من الإخصاب ، كانت الأنابيب الكيدة النامية مرئية. في أطرافها الأمامية ، يمكن اكتشاف تراكم كروي للخلايا التي تمثل النيفرون الأولي المكون. خلال الساعات التالية ، نمت الأنابيب والنيفرون البدائي ، وبدأت البريموديا في الاندماج عند خط الوسط.

في المقابل ، تعطلت تكوين الكلية بشدة في المسوخ. على الرغم من أن الهياكل الأنبوبية الإيجابية ل GFP كانت مرئية بعد 20 ساعة من الإخصاب ، إلا أنها كانت منتشرة ومتخلفة. أظهر التصوير بفاصل زمني أن النيفرونات البدائية لم تتشكل أبدا ، وهاجر عدد مذهل من الخلايا الفلورية الموجودة خارج الكلية النامية بطنيا ، تاركا المجال الكوي.

أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم أن تتذكر أن عدم وجود معدات إضافية ، مثل التحكم في درجة الحرارة أو الجداول المضادة للتبخر يتطلب فحوصات منتظمة للانجرافات وإعادة الضبط. باتباع هذا الإجراء ، يمكن معالجة أجنة الصور لأداء طرق أخرى ، مثل الكيمياء المناعية ، أو تضخم التجزئة ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من أجل تحديد مكونات معينة من الخلايا أو الأنسجة أو لتقييم التعبير الجيني.