تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء اختبار كمي لوظائف الكلى في أسماك الحمار الوحشي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير أجنة أسماك الحمار الوحشي لأول مرة عند 72 HPF. بعد ذلك ، يتم نقل الأجنة إلى قالب حقن وتوجيهها بحيث تكون قلوبها على يسار مجال الرؤية.

ثم يتم حقن تجويف التامور بصبغة فلورية من الكرم الإضافي ويلزم وجود صور فلورية لمنطقة القلب باستخدام مجهر تشريح التألق epi. في النهاية ، يتم تقييم تصفية الكلى لصبغة الفلورسنت باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج قراءة كمية لوظيفة الكلى لأسماك الحمار الوحشي دون الحاجة إلى اختبارات الدم أو المسالك البولية ، والتي لا يمكن تحقيقها في أسماك الحمار الوحشي.

توفر هذه الطريقة أداة قوية لتقييم وظائف الكلى في نماذج مرض الزرد. بعد سحب الإبر وتحضير قالب وفقا لبروتوكول النص ، قم بصب القالب عن طريق صب محلول 2٪ aro المصنوع في ماء السمك أولا في طبق بتري 90 ملم. ضع القالب على طبق بتري ، مما يسمح لحواف الشرائح المكدسة بالغمر بزاوية تحت سطح الزروعة.

اتركه لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة قالب الشريحة واستخدم ماء السمك العذب الذي يحتوي على مخدر trica بنسبة واحد إلى 25. لتغطية الشريحة مطبوعة aros لأداء حقن أسماك الحمار الوحشي من صبغة الفلورسنت.

استخدم إعداد الحقن الدقيق القياسي الذي يتكون من ضاغط هواء متصل بنظام منظم ضغط يتغذى في حامل ماصة مستقيم للاستخدام مع الشعيرات الدموية ذات القطر الخارجي 1.0. يجب وضع حامل الماصة داخل MN 33 compact. مناور دقيق للتحكم بثلاثة محاور مثبت على لوحة قاعدة فولاذية بواسطة مجهر تشريح مستخدم الحامل المغناطيسي لتصور الأجنة ومعالجتها وحقنها مع الحفاظ على أسماك الحمار الوحشي باستخدام الشروط القياسية كما هو موضح في بروتوكول النص.

استخدم خطوط أسماك الحمار الوحشي من النوع البري أو المعدلة وراثيا بما يتناسب مع التجربة. الحفاظ على كثافة تخزين من 15 ذكرا إلى 15 أنثى لكل خزان سعة ثمانية لترات لضمان جمع أكبر عدد من البيض دون إزعاج الأسماك. اغمر خزانات التكاثر في خزانات المخزون البرية في المساء السابق للجمع.

في يوم التجميع ، اترك 30 إلى 40 دقيقة حتى تفرخ الأسماك. ثم استخدم مصفاة شبكية ومياه حوض السمك العذبة لجمع البيض وشطفه. قم بإيداع البيض النظيف في طبق بتري مقاس 90 ملم يحتوي على جنين ومتوسط واحتضان عند 28.5 درجة مئوية لمنع تكوين العضل.

في ثماني ساعات. ما بعد الإخصاب أو HPF. انقل الأجنة القابلة للحياة في الحد الأدنى من السائل إلى أطباق بتري الطازجة التي تحتوي على واحد إلى 100 PTU إلى وسط الجنين واحتضان 28.5 درجة مئوية.

استخدم ملقطا ناعما لكسر نهاية الإبرة. ثم حرك RD إلى طرف الإبرة عن طريق زيادة مدة النبض إلى أقصى حد إلى إعداد الدقيقة. عندما يصل المحلول إلى الطرف، ارجع إلى أجزاء من الثانية.

ضع ميكرومترا على مرحلة المجهر ومع منظم الضغط والتحسينات على طرف الإبرة ، اضبط حجم قطرة الطرد على قطر 100 ميكرون أو حجم 0.5 نانولتر قبل الحقن. قم بإعداد 2 أطباق بتري 35 ملم. يحتوي كل منها على خمسة ملليلتر من وسط الجنين ، وتسمية واحدة ، والأخرى للتعافي.

أضف 200 ميكرولتر من مخزون التريكا إلى الطبق الذي يحمل علامة تراكا. بمجرد أن تصبح جاهزا للحقن ، حدد جنينا فرديا عند 72 HPF. انقل الحد الأدنى من السائل إلى طبق التريكا وراقب نشاط الجنين.

بمجرد تخدير الجنين ، انقله إلى قالب الحقن ووجهه في الحوض بحيث يكون الجانب الأيسر متجها لأعلى. وضع القلب على الجانب الأيسر من مجال الرؤية. لحقن RD في القلب ، استخدم الإبرة لثقب التامور وحقن نانولتر واحد من RD في تجويف التامور.

بعد سحب الإبرة ، انقل الجنين المحقون في الحد الأدنى من السائل إلى طبق الاسترداد وراقبه لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل الجنين الفردي إلى صفيحة 24 بئر تحتوي على مليلتر واحد من وسط الجنين الطازج الذي يحتوي على PTU والملصق بشكل مناسب. بعد حقن ما لا يقل عن 10 أجنة لكل مجموعة تجريبية ، احتضن عند 28.5 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ثلاث ساعات من الحقن أو الأجنة المخدرة HPI كما هو موضح سابقا. وانقله إلى طبق بتري مقاس 35 ملم يحتوي على 3٪ ميثيل السليلوز. ادفع الأجنة برفق إلى ميثيل السليلوز وقم بتوجيهها بحيث يمكن تصوير الجانب الجانبي.

باستخدام مرشح انبعاث 570 نانومتر للأشعة فوق البنفسجية ، احصل على صورة للجنين. اسمح للجنين بالتعافي قبل استبداله في البئر المخصص للحصول على صور لجميع الأجنة المحقونة ، ثم استمر في الحضانة عند 28.5 درجة مئوية. بعد الحصول على جولة ثانية من الصور بقوة 24 حصان ، أستخدم برنامج Image J لتحديد شدة التألق لكل جنين محقون عن طريق فتح صورة وتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار.

باختيار تحرير التحديد، حدد القيمة وقم بتعيينها عند 100 بكسل مربع. ضع القلب في وسط عائد الاستثمار واختر التحليل وتعيين القياسات واضبط القياسات لتشمل متوسط المقياس الرمادي والمساحة. ثم قم بإجراء القياس ، وحدد كمية التألق لكل مجموعة من الصور بثلاثة HPI و 24 HPI لكل جنين وانقل متوسط قيم المقياس الرمادي إلى جدول بيانات لمزيد من المعالجة.

استخدم البرنامج المناسب لإجراء التحليل الإحصائي ومقارنة المجموعات من حيث الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار T الخاص بالطالب كما هو موضح هنا. أدى حقن RD في أسماك حقن bbbs تسعة أسماك مورفو إلى إصابة 40٪ من الأجنة بتكيسات فريك معرضة بعد خمسة أيام من الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت أسماك المورفين انخفاضا في القدرة على إزالة صبغة الفلورسنت بعد 24 HPI مقارنة بالضوابط.

مرة واحدة يجب حقن مجموعة من 10 أسماك في غضون 15 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الاستفادة من الشفافية البصرية لأسماك الزرد لمراقبة التخليص الزمني لصبغة الفلورسنت المحقونة الدقيقة كميا كقراءة فعالة لوظيفة كلية الزرد.