تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مقايسة كمية لوظائف الكلى في سمك الزيبرا. ويتم تحقيق ذلك أولاً بتخدير أجنة سمك الزيبرا عند 72 HPF. بعد ذلك، تُنقل الأجنة إلى قالب حقن وتُوجّه بحيث تكون قلوبها إلى يسار مجال الرؤية.

بعد ذلك، يتم حقن التجويف التأموري بصبغة فلورية من نوع rumine dextra، ويتم التقاط صور فلورية لمنطقة القلب باستخدام مجهر تشريحي فلوري علوي (epi fluorescence). وفي النهاية، يتم تقييم تصفية الكلى للصبغة الفلورية باستخدام المجهر الفلوري العلوي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر قراءة كمية لوظائف كلى سمكة الزيبرا دون الحاجة إلى إجراء فحوصات دم أو بول، وهي فحوصات غير ممكنة في سمكة الزيبرا.

توفر هذه الطريقة أداة قوية لتقييم وظائف الكلى في نماذج أمراض سمك الزيبرا. بعد سحب الإبر وتجهيز القالب وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بصب القالب عن طريق سكب محلول agar بتركيز 2% مُحضر في ماء الأسماك أولاً في طبق بتري بقطر 90 مليمتر. ضع القالب على طبق بتري، مع السماح لحواف الشرائح المكدسة بأن تغمر بزاوية تحت سطح agar.

اتركه ليجمد لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة قالب الشريحة واستخدم مياه أسماك جديدة تحتوي على مخدر trica بنسبة 1 إلى 25. قم بتغطية الشريحة المطبوعة بالأغاروس لإجراء حقن صبغة فلورية لأسماك الزيبرا.

استخدم تجهيزات الحقن المجهري القياسية المكونة من ضاغط هواء متصل بنظام منظم ضغط يتصل بحامل ماصات مستقيم لاستخدامه مع شعيرات قطرها الخارجي 1.0. يجب وضع حامل الماصة داخل جهاز MN 33 compact. استخدم جهاز تحكم مجهري ثلاثي المحاور مثبت على لوحة قاعدة فولاذية بواسطة حامل مغناطيسي، ومجهر تشريح لرؤية الأجنة ومعالجتها وحقنها، مع الحفاظ على أسماك zebra fish في الظروف القياسية الموضحة في البروتوكول النصي.

استخدم سلالات أسماك الزيبرة من النوع البري أو المعدلة وراثياً حسب ما يتطلبه التجربة. حافظ على كثافة تخزين تبلغ 15 ذكراً و15 أنثى لكل حوض سعة ثمانية لتر لضمان جمع أكبر عدد ممكن من البيض دون إزعاج الأسماك. اغمر أحواض التكاثر داخل أحواض تخزين النوع البري في المساء الذي يسبق عملية الجمع.

في يوم الجمع، اترك الأسماك لمدة تتراوح بين 30 إلى 40 دقيقة لوضع البيض. بعد ذلك، استخدم مصفاة شبكية ومياه حوض أسماك نقية لجمع البيض وشطفه. ضع البيض المنظف في طبق بتري بقطر 90 ملليمتر يحتوي على وسط جنيني، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية لتثبيط تكوين العضلات.

بعد ثماني ساعات من الإخصاب أو بعد ساعات من الإخصاب (HPF)، تُنقل الأجنة الحيوية بكمية قليلة من السائل إلى أطباق بتري جديدة تحتوي على 1 إلى 100 PTU في وسط نمو الأجنة، وتُحضن لاحقاً عند درجة حرارة 28.5 درجة Celsius.

استخدم ملاقط دقيقة لكسر طرف الإبرة. بعد ذلك، حرك RD إلى طرف الإبرة عن طريق زيادة مدة النبضة إلى الإعداد الدقيق (minute setting). وعندما يصل المحلول إلى الطرف، عد إلى استخدام الميلي ثانية (milliseconds).

ضع الميكرومتر على منصة المجهر، وباستخدام منظم الضغط والتعديلات الدقيقة لطرف الإبرة، اضبط حجم القطرة الطاردة لتكون بقطر 100 ميكرون أو بحجم 0.5 نانولتر قبل الحقن. جهز طبقين من أطباق بتري مقاس 35 مليمتر، بحيث يحتوي كل منهما على خمسة مليلتر من وسط الأجنة، وقم بتسمية أحدهما "trica" والآخر "recovery".

أضف 200 µL من محلول trica المركز إلى الطبق المسمى trica. وعندما تصبح جاهزاً للحقن، اختر جنيناً واحداً عند 72 HPF. انقل الحد الأدنى من السائل إلى طبق trica وراقب نشاط الجنين.

بمجرد تخدير الجنين، انقله إلى قالب الحقن ووجهه في الميزاب بحيث يكون الجانب الأيسر متجهًا للأعلى، مع وضع القلب على الجانب الأيسر من مجال الرؤية. ولحقن الـ RD في القلب، استخدم الإبرة لثقب التأمور وحقن 1 nanoliter من الـ RD في التجويف التأموري.

بعد سحب الإبرة، انقُل الجنين المحقون في حد أدنى من السائل إلى طبق الاستعادة وراقبه لمدة دقيقة واحدة. ثم انقُل كل جنين على حدة إلى طبق ذي 24 بئراً يحتوي على 1 mL من وسط أجنة طازج يحتوي على PTU وقم بوضع الملصقات المناسبة. بعد حقن ما لا يقل عن 10 أجنة لكل مجموعة تجريبية، قم بالتحضين عند 28.5 °C لمدة ثلاث ساعات.

بعد مرور ثلاث ساعات من الحقن (HPI)، يتم تخدير الأجنّة كما تم وصفه سابقاً، ثم تُنقل إلى طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على 3% ميثيل سليلوز. يتم دفع الأجنّة برفق داخل الميثيل سليلوز وتوجيهها بحيث يمكن تصوير الجانب الجانبي.

باستخدام مرشح انبعاث بطول موجي 570 نانومتر للضوء فوق البنفسجي، يتم التقاط صورة للجنين. يُترك الجنين لفترة من الوقت للتعافي قبل إعادته إلى البئر المخصص، ثم يتم التقاط صور لجميع الأجنة المحقونة، وتستمر بعدها عملية التحضين عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية. بعد التقاط جولة ثانية من الصور عند 24 HP، أستخدم برنامج Image J لقياس شدة الفلورة لكل جنين محقون عن طريق فتح الصورة وتحديد منطقة الاهتمام (ROI).

من خلال اختيار تحرير التحديد (edit selection)، قم بتحديد وضبط القيمة عند 100 بكسل مربع. ضع القلب في مركز منطقة الاهتمام (ROI) واختر تحليل (analyze)، ثم قم بتحديد القياسات (measurements) واضبطها لتشمل متوسط التدرج الرمادي (mean gray scale) والمساحة (area). بعد ذلك، قم بإجراء القياس، وكمي الفلورة لكل مجموعة من الصور عند 3 HPI و 24 HPI لكل جنين، وانقل قيم متوسط التدرج الرمادي إلى جدول بيانات لمزيد من المعالجة.

استخدم برنامجاً مناسباً لإجراء التحليل الإحصائي ومقارنة المجموعات لتحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t للطلاب (student's T-test) كما هو موضح هنا. أدى حقن RD في تسعة أسماك Morpho محقونة إلى تطوير 40% من الأجنة لأكياس prone fric بحلول اليوم الخامس بعد الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت أسماك morphin انخفاضاً في القدرة على التخلص من الصبغة الفلورية بعد 24 HPI مقارنة بمجموعات الضبط.

يمكن حقن مجموعة مكونة من 10 أسماك خلال 15 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الاستفادة من الشفافية البصرية لأسماك zebrafish لمراقبة التصفية الزمنية لصبغة فلورية محقونة مجهرياً بشكل كمي، وذلك كقراءة فعالة لوظائف الكلى في أسماك zebrafish.