توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق في فيفو و في المختبر فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل حركية النمط الظاهري لتوليد وأعداد الخلايا التائية التي تنتجها أسلاف ترسيب الغدة الصعترية E 13 أو E 18. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الفصوص الصعترية أولا عن أجنة الفئران E 13 و E 14 و E 18. في الخطوة الثانية ، يتم تشعيع الفصوص الصعترية E 14 ثم استعمارها بخلايا E 13 أو E 18 المرتبة بالتدفق لمدة 48 ساعة في قطرة معلقة.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تطعيم الفصوص المستعمرة تحت كبسولة الكلى لثلاثة فئران بالضربة القاضية. في النهاية ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم وجود ذرية السلف المستقر للصعترية E 13 و E 18 في دم الوهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لأساليبنا الحالية ، مثل زراعة الخلايا التائية في المختبر على الخلايا الابتدائية ، هي أن هذه التقنية تجمع بين الطرق التي تسمح بالنضج الكامل للخلايا التائية من أسلاف محددة في فحص ثلاثي الأبعاد مع تطعيم مزارع أعضاء الغدة الصعترية في الفئران المتلقية السليمة ، مما يسمح بتقييم تمايز ووظيفة أسلاف شرائح الغدة الصعترية والذرية.

بصفتي مهندس أبحاث يتمتع بخبرة في جراحة القوارض ، سأعرض الإجراء قبل يومين من تجربة التطعيم في غطاء التدفق الصفحي ، ما هو بطن أنثى فأرة حامل بنسبة 70٪ من الإيثانول وعمل شق طولي في الجلد عند خط الوسط ، اسحب الجلد بعيدا لفتح الشق ثم استخدم الملقط والمقص لفتح الصفاق دون لمس الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، اسحب الرحم المشقوق واستخدم المقص لفصله عن المهبل. ثم ضع الرحم في طبق بتري مقاس 90 × 15 ملم يحتوي على 40 إلى 50 مل من DPBS وقم بتقطيعه بشكل عرضي بين الأجزاء الديسيدوية لكل جنين.

استخدم زوجا من المقصات ذات الأطراف الدقيقة والملقط الناعم لإزالة الغشاء العضلي للرحم ، مما يؤدي إلى قطع المشيمة وكيس الصفار لإخراج كل جنين. ثم قم بإزالة السلى الذي يحتفظ بالأجنة ، وضع الأجنة في طبق بتري جديد يحتوي على HBSS بالإضافة إلى 1٪ FCS. لعزل الغدة الصعترية ، ضع الأجنة واحدة تلو الأخرى في وضع ضعيف تحت عدسة مكبرة مجهرية.

ثم أدخل ملقطا طوليا على طول غضروف القص واضغط وافتح الشبكة الصدرية باستخدام ملقط منحني. اسحب الجدار الصدري جانبا لتصور الفصوص الصعترية على كل جانب من القصبة الهوائية. ثم اضغط تحت الغدة الصعترية باستخدام ملقط ناعم لإزالة كل فص بعناية ووضعه في طبق بتري يحتوي على مليلتر واحد من HBSS بالإضافة إلى 1٪ FCS.

بعد ذلك ، استخدم ملقطين دقيقين لإزالة النسيج الضام المحيط دون الإضرار بالفصوص. ثم اغسل الفصوص في ثلاثة ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى 1٪ FCS للقضاء على خلايا الدم الحمراء لبدء إشعاع مزرعة الجهاز الغدة الصعترية للجنين. E 14 فص الغدة الصعترية معزولة من CD 45.2 الأجنة كما هو موضح للتو.

دع الفصوص ترتاح لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بتدوير أسلاف تسوية الغدة الصعترية E 13 أو E 18 التي تم فرزها حديثا. أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع إلى تركيز نهائي يبلغ 500 خلية لكل 35 ميكرولتر من الوسط.

ثم ضع قطرة 35 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر آخر من لوحة تيراساكي 60 بئر ولوحة واحدة فص مشع على سطح كل قطرة. أغلق اللوحة واقلبها رأسا على عقب للسماح للخلايا بالوصول إلى القطب القمي للقطرة عن طريق الجاذبية ، وضرب الجانب العلوي من الصفيحة المقلوبة برفق لإجبار الفصوص على الانزلاق إلى الحافة القمية للقطرة. ثم احتضان الصفيحة المقلوبة في حاضنة رطبة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد استعمار الفصوص الصعترية ، تحقق من مستوى تخدير المتلقي من خلال عدم وجود استجابة انعكاسية. ثم ضع قطرة من مرهم العين على كل عين وضع الماوس على جانبها الأيمن تحت غطاء التدفق الرقائقي. ثم احلق المنطقة الجراحية فوق مفصل الساق الخلفية مباشرة.

بعد ذلك ، قم بعمل زوج من القفازات المعقمة وتعقيم المجال الجراحي باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول 10٪ IOD DY DER. استخدم مشرطا لعمل شق 1.5 سم عبر الأنسجة الجلدية ، متبوعا بشق في الأنسجة العضلية. الآن ضع ضغطا طفيفا على جانبي الشق لإجبار الكلى على الخروج من تجويف البطن والحفاظ على رطوبة الكلى بمحلول ملحي.

حافظ على الكلى برعم قطني خارج التجويف خلف الصفاق ، واستخدم ملقطين دقيقين لعمل ثقب من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في الكبسولة. ثم أمسك جدار الكبسولة مفتوحا ، حرك بعناية ما يصل إلى ستة ترقيع فص الغدة الصعترية تحت حافة عمود الكلى ، ثم ضع الكلية مرة أخرى في التجويف خلف الصفاق. خياطة العضلة ، وهو عصاب متبوعا بخياطة الجلد بعقد الجراح الفردية.

ثم بلل الجرح بمحلول بوفيدون يوديد 10٪ ، وضع الفأر على وسادة تسخين 37 درجة مئوية ، ومراقبة الجرح الحيواني والجراحي حتى يتم التعافي تماما لتحديد أفضل طريقة لاستنفاد الخلايا الزعترية الداخلية لتطوير أسلاف الاستعمار. في هذه التجربة ، تمت مقارنة مستويات إعادة تكوين الخلايا التائية في فص الغدة الصعترية المستعمر بعد الإشعاع أو علاج ديوكسي جوين لمدة خمسة أيام. في حين لم يكن هناك فرق في عدد الخلايا الليمفاوية المستعمرة واضحا في اليوم التاسع من الثقافة ، إلا أن الفصوص المشعة احتوت على خلايا تائية أكثر من تلك التي عولجت ب deoxyguine في اليوم 12 ، مما يجعل التشعيع العلاج المفضل لتسهيل نمو الخلايا التائية بعد استعمار الغدة الصعترية لدراسة الإمكانات التنموية لأسلاف ترسيب الغدة الصعترية E 13 و E 18 هنا ، تم استعمار الفصوص الصعترية المشعة E 14 بعدد متساو من نوعي الأسلاف كما لوحظ ، أدت أسلاف تسوية الغدة الصعترية E 13 إلى ظهور عدد أقل من الخلايا الغدة الصعترية والخلايا التائية الموجبة المزدوجة من أسلاف تسوية الغدة الصعترية E 18.

ومع ذلك ، تم زيادة تواتر الخلايا المضغوطة الناضجة ثلاث خلايا موجبة وتم الكشف عن إنتاج الخلايا التائية الظهارية المتغصنة فقط في ذرية أسلاف تسوية الغدة الصعترية E 13 لتحليل الإمكانات في الجسم الحي ل E 13 و E 18 أسلاف ترسيب الغدة الصعترية تم تطعيم الفصوص الصعترية المستعمرة مع كل نوع من الأسلاف تحت كبسولة الكلى من CD ثلاثة متلقين بالضربة القاضية. كما هو موضح للتو كما هو متوقع. أدت أسلاف تسوية الغدة الصعترية E 13 إلى ظهور الخلايا التائية بسرعة أكبر من أسلاف E 18 ، على الرغم من أن عدد الخلايا التائية المنتشرة كان أقل بكثير في سلف تسوية الغدة الصعترية E 13 الذي استعمر بشكل عام بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة التنموي لاستكشاف خصائص المجموعة الفرعية للخلايا التائية ، بعضها من أصل جنيني صارم في نموذج الثدييات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع المسارات التفاضلية والوظيفية لأسلافها لتسوية أسلافهم وذريتهم في بيئة طبيعية حتى وظروف تنافسية.