العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل مجموعتين رئيسيتين من الخلايا التي تم الحصول عليها من عينات خزعة العضلات البشرية بكفاءة عالية وإنتاجية للسماح بتقييم علامات محددة للنمط الظاهري وعوامل النسخ. يتم تحقيق ذلك عن طريق الفصل الأول ، عينة خزعة العضلات البشرية في معلق خلية واحدة في الخطوة الثانية. بعد ثقافة لمدة سبعة أيام ، يتم فصل الخلايا عن طريق فرز حبات مغناطيسية مناعية إلى CD 56 إيجابي ، وهي خلايا عضلية المنشأ وكسور CD 56 سالبة ، وهي الخلايا الليفية.

ثم يتم تلطيخ الخلايا وتصويرها بحثا عن علامات النمط الظاهري والبروتين المطلوبة ذات الأهمية. في النهاية ، يمكن استخدام المجهر المناعي الفلوري وتحليل الصور الكمي لقياس شدة عوامل النسخ الموضعية النووية المختارة داخل مجموعات الخلايا التي تم فرزها. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية ، التي تستخدم فرز الخلايا المغناطيسية المناعية على الطرق الحالية مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، في أنها لطيفة وتسمح بالفرز الممتاز لخلايا العضلات الأولية البشرية ذات الإنتاجية العالية والجدوى ويمكن إجراؤها بسرعة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو زيادة فهمنا للأساس الخلوي لتنكس العضلات الدهنية الليفية التي لوحظت في الشيخوخة ، وكذلك في عدد من أمراض العضلات لعزل الخلايا السليفة المشتقة من العضلات في أسرع وقت ممكن بعد الحصول على الخزعة. أولا ، حدد وزن عينة الأنسجة ثم انتفاخ العضلة في الوسط القاعدي عدة مرات لغسل العينة خالية من الدم الزائد. دع العضلات تترسب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 ثانية ثم استنشق كل ما عدا آخر ملليلتر إلى ثلاثة ملليلترات من الوسط من الأنبوب.

بعد ذلك ، اقلب الأنبوب على طبق بتري معقم للسماح للسائل المتبقي بحمل العضلات إلى الطبق. الآن قم بتنظيف العينة من أي قطع مرئية من أي دهون واضحة أو نسيج ضام. ثم قم بتدوير الطبق لتعبئة الوسائط المتبقية ، ثم قم بشفط كل الوسائط وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول إنزيم الكولاجيناز والتخلص لكل 100 إلى 400 ملليغرام من الأنسجة ، وقم بتقطيع عينة العضلات إلى قطع صغيرة جدا من واحد إلى ملليمترين مكعبات.

عندما تكون العينة مفرومة بما فيه الكفاية. استخدم ماصة خنزير عريضة سعة 25 ملليلتر لنقل شظايا الأنسجة ومحلول الإنزيم إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 10 إلى 20 ملليلترا. اغسل اللوحة بثلاثة ملليلتر أخرى من محلول الإنزيم ثم استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل أي شظايا عضلية متبقية إلى الأنبوب.

ضع الأنبوب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إعادة تعليق الأنسجة كل 15 دقيقة باستخدام ماصة سعة 10 مل. ثم قم بإنهاء التفكك الأنزيمي بكمية مكافئة على الأقل من وسط النمو الطازج المعاد تدفئته.

بعد ذلك ، قم بتمرير تعليق الخلية عبر مرشح 100 ميكرومتر لإزالة أي قطع كبيرة من الحطام ثم الطرد المركزي للخلايا العصيية. الحبيبات في سبعة إلى ثمانية ملليلتر من وسط النمو ، ثم احتضان الخلايا في قارورة ثقافة الأنسجة T 25 غير المطلية. 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام.

في نهاية الأسبوع ، يعين التربسين طبقة واحدة للخلية لمدة ثلاث دقائق. عندما تنفصل الخلايا ، أضف خمسة إلى 10 ملليلتر من نمو العضلات والهيكل العظمي ، وهي متوسطة لمنع الهضم الزائد وتطبيق بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم بعد العد ، احتفظ ببعض الخلايا لتوصيف علامة نسب الخلية واغسل الخلايا المتبقية في 15 مل من كسب أجهزة الطرد المركزي PBS.

هذه المرة ، قم بتعليق الحبيبات في 170 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ، والحد الأقصى للفرز ، والمخزن المؤقت والماصة برفق إلى إعادة الإعصاء. قم بتعليق الخلايا عند 35 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي الصغير المترافق المضاد للجسم المضاد CD 56 المختلط جيدا. امزج محلول الخلية عدة مرات بواسطة الماصة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة من أربع درجات مئوية مع نباتات لطيفة.

في منتصف الطريق بعد الحضانة ، اغسل الخلية ومحلول الخرز ب 10 ملليلتر من جهاز الطرد المركزي العازل للفرز والريوس. الحبيبات في مليلتر واحد من مخزن الفرز الطازج. بعد ذلك ، قم بتشحيم مرشح الفصل والعمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمصادر.

ثم قم على الفور بخلط ونقل المليلتر الكامل من تعليق الخلية من خلال مرشح الفصل المسبق وإلى العمود ، واشطف العمود ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من غسل الطاقة العازلة ، وجمع جزء الخلايا الليفية غير المحتجزة ، والمرور عبر العمود إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر يحتوي على كمية صغيرة من وسط النمو. ثم قم بإزالة العمود من المغناطيس واضغط على المكبس في الجزء العلوي من العمود لتجميع جزء الخلية الموجب CD 56. في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 مليلتر يحتوي على نمو دافئ ، ينبعث وسط نمو متوسط من هذه الخطوة.

إذا كان سيتم إجراء فرز مزدوج ، ففكر في كسور الخلايا الموجبة والسالبة المجمعة. إذا كان المصادر المزدوجة مطلوبا لمزيد من النقاء ، فلا تضع الوسائط في أنبوب التجميع الموجب CD 56 في الفرز الأول ، ولكن كرر الخطوات بدءا من المرشح وتزييت العمود عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة. قم بإصلاح CD 56 مزارع الخلايا الموجبة في وسط استزراعها ، باستخدام حجم مكافئ من الجليد البارد ، 8٪ بارا فورمالديهايد.

10 دقائق مع نباتات لطيفة. ثم استنشق المثبت واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لتلطيخ مستضدات سطح الخلية المناعة. قم بحظر الخلايا لمدة ساعة واحدة على الأقل في 1٪ BSA في PBS ، ثم قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية ثم الثانوية ذات الصلة.

قم بتحسين كاشف اكتساب طاقة الليزر وإعدادات التعرض ذات الصلة بالمجهر والبقع. قبل التصوير ، تلتقط الخلايا صورا للخلايا في العدد المطلوب من قنوات الكشف وفي أكثر من ستة مجالات رؤية مختلفة. للتحليل ، افتح ملفات صور TIFF المناسبة واسحب الصور إلى بعضها البعض لتراكب القنوات المقابلة المناسبة.

ستظهر كل قناة كطبقة منفصلة في لوحة الطبقات. بعد ذلك في نافذة التحليل ، اختر تحديد نقاط البيانات ثم قم بالتخصيص وحدد القياسات المطلوبة. لتحليل شدة التألق النووي، افتح مربع حوار نطاق الألوان وحدد الألوان التي تم أخذ عينات منها من القائمة المنسدلة.

ثم اضغط مع الاستمرار على مفتاح shift ، وحدد النغمات الخاصة بالنوى المسماة. انقر فوق حفظ لتخزين قناع تحديد نطاق الألوان هذا لاستخدامه مع الصور الأخرى المحددة في نفس الجلسة. بمجرد تحديد النوى ، اكتب انقر وحدد تعبئة.

ثم اختر الأسود من القائمة المنسدلة وتأكد من ضبط التعتيم على 100٪التالي ، انقر فوق تحديد وعكس. ثم انقر بزر الماوس الأيمن واختر تعبئة مرة أخرى واختر تعبئة بيضاء من القائمة المنسدلة. قم بإجراء خوارزمية مستجمعات المياه لفصل أي نوى متداخلة جزئيا على الطبقة النووية الثنائية الآن.

انتقل إلى تحديد ثم نطاق الألوان ، ثم الظلال لتحديد النوى المنفصلة الفردية. ثم انقل التحديد إلى الطبقة التي تحتوي على صورة بمقياس رمادي 16 بت للعلامة المطلوبة وانقر فوق قياسات التسجيل. أخيرا ، قم بتصدير القياسات المحددة كملفات نصية إلى برنامج التحليل المناسب لمزيد من معالجة الزيت.

يكشف التلوين الأحمر لمجموعات الخلايا المنقاة جنبا إلى جنب مع التلوين المناعي لعلامات النسب الشحمية والعضلية أن جزء الخلايا الليفية فقط هو القادر على التمايز اللاجني مع التراكم الهائل للدهون بواسطة الخلايا الليفية التي تكون مرئية للعين المجردة ومع مزيد من الإثبات لتحولها الكامل من خلال التعبير القوي عن جاما PPAR النووي بواسطة هذه الخلايا بحلول اليوم 15 من العلاج ، أطلقت هذه الخلايا أي مستضد نسيج ضام TE سبعة A المتبقي على ركيزتها. على النقيض من ذلك ، تحافظ الخلايا العضلية على نمطها الظاهري الطبيعي ، بما في ذلك تعبيرها عن سلسلة الديسمين والميوسين الثقيلة دون تنظيم تعبير جاما PPAR النووي. في هذا الشكل ، يظهر مثال على التحليل الكمي لحقل من خلايا ديزموند العضلية الإيجابية والحقل الذي تم الحصول على هذه البيانات منه يوضح تباين التعبير العضلي في النوى الفردية في كثافة البذر المحددة والنقطة الزمنية.

في هذا الرسم البياني ، يتم توضيح فائدة الطريقة لمقارنة مستويات عامل النسخ مباشرة في أنواع الخلايا المختلفة على مستوى الخلية تلو الأخرى. على سبيل المثال ، تعبر هذه الخلايا الليفية العضلية السلبية CD 56 عن مستوى عال من عامل النسخ النووي الشاحم ، PPAR جاما ، في حين أن الخلايا العضلية الإيجابية المتنوعة CD 56 تحافظ على مستويات منخفضة جدا فقط من عامل نسخ المستقبلات النووية بعد التعرض لوسط تحفيز الخلايا الشحمية. تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال بيولوجيا العضلات باستكشاف آليات قرارات مصير الخلية في عينات العضلات البشرية السليمة أو المرضية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك أولا فهم جيد لكيفية الحصول على عوائد عالية من الخلايا المشتقة من العضلات البشرية المنقاة والمميزة جيدا ، وثانيا ، كيفية إجراء تحليل كمي موضوعي للمكونات الخلوية التي تم تحديدها بواسطة تلطيخ الفلورسنت المناعي.