تحسين مرفق من الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية على بولي (ε-caprolactone) خيوط Electrospun

في هذا الإجراء ، يتم إعداد سقالات PCL المغزولة كهربائيا بطرق مختلفة لتحديد الإعداد الأمثل لتلقيح الخلايا. أولا ، يتم وضع السقالات المعقمة في الإعدادات المختلفة التي يتم فحصها ، بما في ذلك إدخالات زراعة الخلايا ، والأحواض ، والأوعية الدوارة للمفاعل الحيوي. بمجرد وضعها في مكانها ، يتم زرع عدد معروف من الخلايا على السقالة ثم تركها دون إزعاج لمدة 20 دقيقة.

ثم يتم نقل جميع العينات بعناية إلى حاضنة ، وإعداد 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية ، وتخضع لظروف ثابتة أو ديناميكية قبل ساعات. بعد وقت الثقافة هذا ، يتم تحديد عدد الخلايا التي تم ربطها بالسقالة بواسطة اختبار الحمض النووي لتحديد كمية الخلايا في وسائط السقالة وكسور البئر. في النهاية ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد الحمض النووي الموجود على السقالة والبئر وفي الوسائط المحيطة لعرض ارتباط الخلايا بالسقالات المجهرية الإلكترونية أو SEM المستخدم.

خطرت لنا فكرة هذا التحقيق لأول مرة عندما علمنا أن سقالاتنا لا تغطي القاعدة الكاملة للوحة البئر ، مما يعني أن هناك احتمال ألا تكون جميع الخلايا على اتصال بالسقالة وبالتالي قادرة على الارتباط. للبدء ، قم بإعداد إدخالات ثقافة الخلايا تحت تدفق الصفيحة عن طريق فتح إدخالات ثقافة خلايا الآبار الستة المعقمة وفصل الحلقات الأقصر بالأسنان عن الأجسام الحلقية الأوسع. ثم خذ الحلقة مع توجيه الأسنان لأعلى وقم بلف إحدى السقالات التي يبلغ طولها أربعة سنتيمترات فوق وسط الحلقة ، مع التأكد من تداخلها على كلا الجانبين.

خذ الجسم الحلقي وضعه فوق حلقة السن والسقالة. ثم ادفع لأسفل ، وتأكد من بقاء السقالة في موضعها وتقع في مركز مزرعة الخلية. أدخل. ضع إدراج مزرعة الخلية مع سقالة في بئر صفيحة ربط منخفضة بستة آبار ، وأضف 10 مل من وسائط الاستزراع إلى السقالة.

بعد ذلك ، ضع أحواض البولي تترافلورو إيثيلين في أطباق بتري الفردية وأضف 10 مل من وسائط الاستزراع إلى الحوض الصغير. باستخدام الملقط ، قم بلف إحدى السقالات التي يبلغ طولها ثلاثة سنتيمترات في الحوض الصغير ، مع التأكد من أن طوله يقع بالتوازي مع الحافة الأطول للحوض الصغير. لإعداد وعاء المفاعل الحيوي تحت تدفق الصفيحة ، قم بتوزيع 10 ملليلتر من المحلول الملحي المعقم المخزنة بالفوسفات أو PBS من خلال المنفذ الرئيسي لوعاء المفاعل الحيوي.

بعد 10 دقائق ، قم بإزالة PBS واستبدلها بثمانية ملليلتر من وسائط الثقافة باستخدام الملقط. أدخل إحدى السقالات التي يبلغ طولها ثلاثة سنتيمترات في السفينة عبر المنفذ الرئيسي. ثم قف قبالة المنفذ الرئيسي.

بعد إجراء عد الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بشفط الوسائط من أنبوب الطرد المركزي تاركا حبيبات الخلية واستبدلها بحجم الوسائط المحسوب. يقوم Resus بتعليق الخلايا والوسائط للحصول على مزيج متساو. باستخدام ماصة P 200 Gilson ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية ببطء في كل سقالة عن طريق تمرير طرف الماصة على طول السقالة وأسفل سطح سائل الوسائط.

اتركيه دون إزعاج لمدة 20 دقيقة ، أو استغن أوعية المفاعل الحيوي عن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية من خلال المنفذ الرئيسي. قم بتعبئة المليلترين المتبقيين من وسائط الاستزراع بواسطة منافذ الحقن لإعطاء حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر. بعد ذلك ، انقل أوعية المفاعل الحيوي إلى المفاعل الحيوي للوعاء الدوار ، واضبطه على التدوير.

عند تسعة دورة في الدقيقة ، انقل ألواح البئر مع إدخالات وأحواض ثقافة الخلايا إلى لوحة شاكر واضبطها على الدوران عند 30 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ أو الثقافة الثابتة. انقل ألواح البئر مع إدخالات وأحواض زراعة الخلايا إلى رف حاضنة زراعة الخلايا. ضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد أربع ساعات ، أخرج العينات من الحاضنة وضعها تحت تدفق الصفيحة. بعد ذلك ، قم بإزالة كسور الوسائط من جميع العينات وضعها في أنابيب طرد مركزي ذات علامات منفصلة. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 241 مرة G ، قم بإزالة supinate قبل إضافة ثلاثة ملليلتر من دوامة عازلة التحلل ، وهو الحل لتفكيك بيليه الخلية السقالات الموجودة داخل إدراج ثقافة الخلية أولا ، قم بتحرير السقالة عن طريق قطع السقالة بالقرب من حافة الإدراج باستخدام سقالة.

ثم باستخدام الملقط ، قم بإزالة السقالات وضعها في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على ثلاثة ملليلتر من محلول التحلل. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل وعاء سقالة وكشط السطح. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل وضعه في أنابيب طرد مركزي ذات علامات منفصلة.

دوامة كل أنبوب طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة تقريبا لضمان التحريك الكافي وتشجيع تحلل غشاء الخلية. في صفيحة سوداء 96 بئر ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لكل وسائط سقالة جزء عينة ، ثم في الظلام ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للخلية إلى جميع الآبار التي تحتوي على عازلة التحلل واخلطها. قم بتضمين الآبار برفق مع محلول التحلل الذي لا يحتوي على الحمض النووي ومحلول الحمض النووي الخلوي لتوفير تحكم سلبي وإيجابي للوحة البئر.

باستخدام قارئ لوحة مضان ، قم بقياس امتصاص الآبار عند إثارة 485 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر. قارن البيانات بالمنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه من معايير الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإجراء تثبيت SEM. بعد أربع ساعات من الحضانة ، قم بإزالة جميع السقالات من أوعية الآبار وضعها داخل آبار منفصلة من صفيحة جديدة مكونة من ستة آبار وتدفق صفيحة.

ثم اغسل السقالات مرتين باستخدام PBS لكل منها. حسنا ، أضف ملليلترين من 1.5٪ جلوتارالديهايد في PBS لضمان التغطية الكاملة في السقالة. اترك الطبق لمدة 30 دقيقة على الأقل عند أربع درجات مئوية لتثبيت cel.

قم بإزالة المحلول المثبت واغسل السقالات مرتين باستخدام PBS. ثم انقل السقالات إلى صفيحة بئر جديدة لتجفيفها بتركيزات متزايدة من الإيثانول في الماء المقطر ، بدءا من 50٪ إيثانول متبوعا بنسبة 70٪ ثم 90٪ لكل تركيز. اغمر السقالات بالكامل في المحلول واتركها لمدة ثلاث دقائق قبل التخلص من المحلول وتكرارها.

بمجرد تجفيف السقالات في 100٪ من الإيثانول عن طريق غمر السقالات بالكامل في المحلول وتركها لمدة خمس دقائق ، تخلص من المحلول وكرر تجفيف السقالات كيميائيا. استخدام HMDS داخل خزانة الدخان. اغمر السقالات في HMDS واتركها لمدة خمس دقائق قبل إزالة HMDS بعد التكرار مرة واحدة.

قم بإزالة HMDS واترك السقالات تجف. ثم قم بتركيب السقالات على بذرة SEM المتوفرة تجاريا لتسهيل المشاهدة داخل معطف SEM ، والعينات ذات طبقة نقاطة ذهبية لمدة دقيقتين لضمان تغطية رقيقة ومتساوية. أخيرا ، ضع العينات داخل SEM وتصور السقالات الجالسة في الخلية باستخدام شعاع إلكتروني قبو إلكترون يبلغ وزنه خمسة كيلوغرامات.

النتائج الضوء على موقع الخلايا بعد أربع ساعات من البذر لكل إعداد تجريبي تم فحصه. يوضح هذا الشكل النسبة المئوية للخلايا التي تم التصاق بسطح السقالة خلال هذا الوقت حيث تم فحص جميع إعدادات البذر. النسبة المئوية لارتباط الخلية منخفضة نسبيا ، ولكن أكبر التصاق الخلوي بالسقالات الموجودة داخل إدخالات زراعة الخلايا وتهتز عند 30 دورة في الدقيقة.

أقل التصاق للسقالات الموجودة داخل إدخالات زراعة الخلايا وحفظها في ظروف ثابتة. كان هناك عدد كبير من الخلايا داخل جزء الوسائط ، وعلى الأخص لزراعة الخلايا. أظهرت الإدخالات الموجودة داخل ألواح ربط منخفضة بنسبة 50٪ والأوعية الدوارة عند 51٪ من السقالات الموجودة داخل الأحواض عددا مرتفعا من الخلايا الموجودة داخل الحامل نفسه.

48٪ لشاكر الحوض و 50٪ للمسح الثابت للحوض الصغير. سمح الفحص المجهري الكهربائي بإجراء تقييم بصري للسقالات المصنفة في الخلية. سلطت الصور التمثيلية الضوء على وجود محدود للخلايا على السطح الليفي بغض النظر عن إعداد البذر.

ومع ذلك ، كان هناك عدد أكبر من الخلايا وتكتلات الخلايا موجودة على السقالات الموجودة داخل إدخالات زراعة الخلايا واهتزت عند 30 RP M.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد أن بذر عدد معروف من الخلايا لا يعادل بالضرورة أن العديد من الخلايا التي ترتبط بالفعل بالسقالة ، خاصة بالنسبة للسقالات التي لا تغطي قاعدة الصفائح البرية بأكملها. بالنسبة للسقالات مثل هذه ، يوصى أولا بتحسين إعدادات بذر الخلايا المختلفة من أجل زيادة الارتباط الأولي للخلية بالسقالة.