عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا بسرعة باستخدام فحص عالي المحتوى أو نظام HCS. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم وإعداد التجارب أولا للوحة 96 بئر ، ثم طلاء المجموعات المختلفة للخلايا الجذعية الهندسية. بعد ذلك ، يتم إعداد نظام الفحص عالي المحتوى لتصوير الخلايا الحية ثم يبدأ التصوير بفاصل زمني للفترة الزمنية المطلوبة.

ثم بعد الانتهاء من التصوير بفاصل زمني ، يتم تحضير لوحة الثقافة لإجراءات تلطيخ الخلايا مثل يوديد البروبيديوم ، أو تلطيخ موت الخلايا ، أو وضع العلامات المناعية KI 67 لتوصيف تكاثر الخلايا. أخيرا ، يتم إعادة تحميل لوحة البئر 96 في نظام الفحص عالي المحتوى للتصوير الفلوري والحصول على الصور. في النهاية ، يتم استخدام برنامج تحليل الصور لإجراء تحليل البيانات لتحديد معلمات نمو الخلايا المختلفة.

يمكن أن تساعد هذه المنهجية في معالجة القضايا الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، مثل تحديد وتوصيف العوامل التي تحفز تمايز الخلايا الجذعية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الاستراتيجيات العلاجية القائمة على الخلايا بسبب أهمية توصيف أنواع الخلايا قبل استخدامها في الجسم الحي. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لسلوكيات الخلايا ويمكن تطبيقها تقريبا على أي نوع آخر من الخلايا ينمو جيدا في الثقافة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الأساليب على الكائنات الحية بأكملها مثل يرقات سمك الزرد. للبدء ، قم بإنشاء خريطة كما هو موضح هنا للوحة البئر 96 التي تحدد الركائز وأنواع الخلايا المختلفة التي سيتم فحصها تحت غطاء مزرعة معقم. قم بإعداد محطة عمل مع ركائز مختلفة ولوحة 96 بئر.

أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة لكل منها ، حسنا وفقا للخريطة. ثم استخدم شريطا من perfil لإغلاق الغطاء وتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل بعد عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للفأر وإصابتها بنواقل الفيروسات العدسية وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة محاليل الركيزة من لوحة البئر 96 واستخدم حوالي 200 ميكرولتر من PBS المعقم لغسل الآبار مرتين. بمجرد إزالة الشطف النهائي عند 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا وموازنة اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في غضون ذلك ، في ظل ظروف معقمة ، قم بحصاد الخلايا الجذعية الجذعية عن طريق جمع وسط النمو أولا ، والذي يشار إليه الآن باسم الوسط المكيف من القارورة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ثم أضف ثمانية ملليلتر من PBS المعقم إلى القارورة وقم بتحريكه برفق قبل شفط المخزن المؤقت لفصل الخلايا عن القارورة ، أضف مليلتر واحد من محلول 0.05٪ تريبسين و 0.01٪ EDTA. عندما تنفصل الخلايا ، أضف ثمانية ملليلتر من الوسط المكيف قبل جمع تعليق الخلية وإعادة طلاء الخلايا بحوالي 300 خلية لكل بئر.

وفقا لبروتوكول النص ، احتضن اللوحة لمدة ساعتين للسماح للخلايا الجذعية بالالتصاق بالركيزة أثناء احتضان الخلايا. ابدأ نظام HCS وانتظر ساعتين حتى يتوازن. اضبط وحدة التحكم البيئية على 37 درجة مئوية وقم بتشغيل أسطوانة الغاز المختلطة التي تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الهواء بعناية إلى نظام HCS ، وهي غرفة بيئية توفر مصدر هواء ثابت.

بعد ذلك ، بعد فترة الحضانة التي استمرت ساعتين ، قم بإزالة لوحة البئر 96 من الحاضنة وضعها مباشرة في الغرفة البيئية لنظام HCS. بعد السماح للوحة بالتوازن لمدة 30 دقيقة ، ابدأ تشغيل البرنامج لتكوين إعدادات اللوحة. بمجرد إعداد معلمات التصوير ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم التركيز البؤري التلقائي بالليزر للتركيز على قاع البئر والتقاط صور اختبار من مواقع متعددة وآبار متعددة للعثور على مستوى بؤري محسن.

بمجرد تحديد التركيز ، ابدأ في التقاط الصور كل خمس دقائق لمدة 48 ساعة لجميع الآبار ال 60. في نهاية التجربة ، قم بإزالة لوحة البئر 96 من نظام HCS في ظل ظروف معقمة ، واجمع عينات متوسطة مكيفة من كل بئر وانقلها إلى صفيحة 96 بئر جديدة. يمكن استخدام هذه العينات لاحقا ل ELIZA لإجراء اختبار تكاثر الخلايا KI 67.

استخدم 0.1 محلول فوسفات مولار لشطف مزارع الخلايا لمدة دقيقة واحدة. بعد تكرار الغسيل ، استخدم 4٪ من فارمالديهايد أو PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الثقافات بعد التثبيت. قم بإزالة PFA واستخدم PBS لشطف الآبار ثلاث مرات لمدة سبع دقائق لكل منها.

بعد حجب الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، ضع 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي على كل منها. قم بتغطية الطبق جيدا واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة سبع دقائق.

لكل غسلة ، ضع الجسم المضاد الثانوي. ضع الخلايا في الظلام واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة بعد ثلاث غسلات أخرى. غطي الطبق واحفظيه على أربع درجات مئوية حتى التصوير.

لإجراء التصوير الآلي ، قم بتحميل اللوحة ذات العلامات المناعية في نظام HCS واسمح للوحة بالتوازن لمدة 20 دقيقة. افتح برنامج الحصول على صور نظام HCS وتحليلها. اختر إعدادات الاكتساب لهدف 10 × باستخدام ثني الكاميرا عند واحد وإعداد كسب اثنين.

استخدم وظيفة التعريض التلقائي للعثور على المستوى Z الذي توجد فيه الخلايا وحساب الإزاحة لكل طول موجي ذي أهمية للتحليل الموضح هنا. التقط صورا ل DAP EGFP و S3. اختر الحد الأقصى لمستوى الكثافة الذي لا تظهر عنده آبار التحكم السلبية أي إشارة للحصول على الصورة. استخدم نفس إعدادات العتبة للآبار الموجبة.

أخيرا ، التقط الصور واحفظها في قاعدة بيانات قبل إجراء تحليل الصور. وفقا لبروتوكول النص ، كما هو موضح هنا ، تم طلاء خمس مجموعات مختلفة من الأنواع الفرعية ل MSC في 96 لوحة زراعة أنسجة البئر مشفرة مسبقا بركائز مختلفة في هذا الشكل ، anti KI 67 ، الذي يحدد الخلايا المتكاثرة ، وتم استخدام DAPI لتقييم ما إذا كانت الركائز المختلفة قد أثرت على تكاثر المجموعات السكانية المختلفة للخلايا الجذعية الجذعية الهندسية كما هو موضح هنا ، على الرغم من وجود اختلاف في النسب المئوية للخلايا الجذعية الجذعية المتكاثرة ، إلا أن جميع الركائز دعمت تكاثر الخلايا الكبير لكل نوع فرعي من MSC. توضح هذه المؤامرة أن النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على تلطيخ بيوديد البروبيديوم أو PI ، والتي تحدد الخلايا الميتة في مجموعة سكانية منخفضة في جميع الركائز التي تم فحصها والمعالجة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، والذي يقتل معظم الخلايا ، وأظهرت معدلا عاليا من وضع العلامات على PI وتعمل كعنصر تحكم إيجابي للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية الجذعية على ركائز مختلفة.

تم تحليل هجرة الخلايا على مدى 29 ساعة باستخدام الفحص المجهري الرقمي بفاصل زمني. يتم تمييز مسار الترحيل للخلية الأولى والخلية الثانية بالخط الأخضر والأزرق على التوالي. كما هو موضح هنا ، أظهرت جميع الأنواع الفرعية من الخلايا الجذعية الجذعية أسرع معدل هجرة على المصفوفة خارج الخلية ، والأسطح المطلية ، والأبطأ على أسطح البوليسترين غير المطلي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تخطيط التجربة وتصميمها بعناية لتنسيق لوحة متعددة الآبار ، مثل لوحة 96 بئر باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل Eliza S على وسائط الحالة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بإنتاج وإفراز العوامل العلاجية بواسطة الخلايا الجذعية المهندسة بعد تطويرها. مهدت إجراءات الفحص عالية المحتوى الطريق للباحثين في مجالات بيولوجيا الخلايا الجذعية واكتشاف الأدوية لاستكشاف الأنظمة البيولوجية المعقدة بطريقة عالية الإنتاجية.