توصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المعدلة وراثيا لتطبيقات العلاج العصبي

ابدأ بالخلايا الجذعية الوسيطة للفأر المعدلة وراثيا - خلايا متعددة القدرات مشتقة من نخاع العظام.

تم تصميم الخلايا للتعبير عن GFP والعوامل العصبية العلاجية التي تدعم نمو الخلايا العصبية وبقائها على قيد الحياة.

اغسل الخلايا بالمخزن المؤقت وقم بإصلاحها للحفاظ على سلامة الخلايا.

اغسل مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت ، ثم أضف محلولا لاختراق الخلية والأغشية النووية وسد مواقع الارتباط غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتين علامة تكاثر الخلايا المعبر عنها حصريا في نواة الخلايا المنقسمة.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية وصبغة مرتبطة بالحمض النووي لمواجهة النوى.

يغسل بمخزن مؤقت لإزالة الكواشف غير المرتبطة.

قم بتحميل اللوحة في نظام الفحص عالي المحتوى والتقط الصور لاكتشاف إشارات الفلورسنت.

التعبير عن علامة تكاثر الخلايا إلى الانقسام النشط للخلايا ، مما يشير إلى ملاءمة الخلايا المعدلة وراثيا لتطبيقات العلاج العصبي.

لإجراء فحص تكاثر خلايا Ki-67 ، استخدم عازلة فوسفات 0.1 مولار لشطف مزارع الخلايا لمدة دقيقة واحدة. بعد تكرار الغسيل ، استخدم 4٪ بارافورمالدهيد ، أو PFA ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الثقابات.

بعد التثبيت ، قم بإزالة PFA واستخدم PBS لشطف الآبار ثلاث مرات لمدة سبع دقائق لكل منها. بعد حجب الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، ضع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل بئر. غطي الطبق واحتضنه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.

بعد غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة سبع دقائق لكل غسلة ، ضع الجسم المضاد الثانوي ، ضع الخلايا في الظلام ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. بعد ثلاث غسلات أخرى ، قم بتغطية الطبق وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.

لإجراء التصوير الآلي ، قم بتحميل اللوحة ذات العلامات المناعية في نظام HCS والسماح للوحة بالتوازن لمدة 20 دقيقة. افتح برنامج الحصول على صور نظام HCS وتحليلها. اختر إعدادات الاكتساب لهدف 10X باستخدام تجميع الكاميرا عند 1 وإعداد الكسب 2.

استخدم وظيفة التعريض الضوئي التلقائي للعثور على المستوى Z الذي توجد فيه الخلايا ، وحساب الإزاحة لكل طول موجي محل اهتمام. للتحليل الموضح هنا ، التقط صورا ل DAPI و GFP و Cy3.

اختر الحد الأقصى لمستوى الكثافة الذي لا تظهر عنده آبار التحكم السلبية أي إشارة للحصول على الصورة. استخدم نفس إعدادات العتبة للآبار الموجبة. أخيرا ، التقط الصور واحفظها في قاعدة بيانات ، قبل إجراء تحليل الصور وفقا لبروتوكول النص.