تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

الهدف العام من هذا الفحص في المختبر كيناز هو تحديد مواقع الفسفرة في بروتين ذي أهمية خاص بكيناز المعتمد على سيكلين كيناز 1. يعد تحديد مواقع الفسفرة الخاصة ب CDK1 أمرا مهما لأنها توفر رؤى ميكانيكية حول كيفية تحكم CDK1 في دورة الخلية. يعد تنظيم دورة الخلية أمرا بالغ الأهمية لفصل الكروموسومات الكاملة الطور وتؤدي العيوب إلى انحرافات الكروموسومات والسرطان.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعتمد على البروتينات المنقاة وبالتالي يمكن تطبيقها على أي كائن حي نموذجي وتعطي نتائج موثوقة ، خاصة عند دمجها مع الدراسات الوظيفية في الخلايا. هذه الطريقة مهمة لأن العدد المعروف لأهداف CDK1 لا يزال منخفضا ، على الرغم من حقيقة أن CDK1 يفسفري ما يقدر بثمانية إلى 13٪ من البروتيوم. على الرغم من أن هذه الطريقة تحدد مواقع الفسفرة الخاصة ب CDK1 ، إلا أنه يمكن تعديلها لتحديد مواقع الفسفرة للكينازات الأخرى بشرط أن يكون الكيناز المنقى متاحا.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن ظروف اختبار كيناز يجب تحسينها لكل هدف بروتين للحصول على كفاءة فسفرة عالية. يفضل استخدام برنامج IGPS 3.0 بنسبة 100٪ وزيارة خادم الويب للتنبؤ بمواقع الفسفرة الخاصة ب CDK1 في تسلسل البروتين المستهدف CENP-F. تحقق من مواقع الفسفرة مقابل تسلسل إجماع CDK1.

ابدأ التعبير عن البروتين عن طريق إعداد ما قبل الزراعة. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بتحويل ميكرولتر واحد من بلازميد التعبير إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية. بعد إضافة البلازميد ، احتضن الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ثم احتضان الخلايا لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية. بعد الحضانة ، ضع الخلايا على الجليد لمدة دقيقة واحدة ثم أضف 400 ميكرولتر من LB إلى الخلايا ، ثم احتضن المزرعة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية أثناء الرج. ثم قم بتركيب 200 ميكرولتر من المزرعة على ألواح أجار LB ، مع استكمالها بالمضادات الحيوية ذات الأهمية ، اعتمادا على البناء.

بعد ذلك ، احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 20 ساعة دون اهتزاز. ثم اختر مستعمرة من لوحة أجار LB وقم بتلقيح المستعمرة في 50 مل من وسط LB المكمل بتركيبة المضادات الحيوية المرغوبة. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بسرعة 160 إلى 180 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 20 ساعة.

لكل لتر من وسط LB أضف المضادات الحيوية و 10 ملليلتر من 40٪ الوزن حسب حجم محلول الجلوكوز المصفى المعقم. أضف إلى هذه الوسيلة 20 مل من الثقافة المسبقة المزروعة بكثافة. ثم احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية بينما تهتز بسرعة 160 إلى 180 دورة في الدقيقة.

تحقق من امتصاص المزرعة عند 600 نانومتر على فترات منتظمة. بمجرد أن يصل الامتصاص إلى 0.5 إلى 0.6 ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين بإضافة 0.2 مللي مولار IPTG. ثم احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات أثناء الرج.

بعد ثلاث ساعات ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4 ، 100 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، باستخدام دوار متأرجح. بعد الطرد المركزي ، طرد المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من المخزن المؤقت لربط ضريبة السلع والخدمات ل CENP-F وستة مخزن مؤقت ملزم لكاريوفيرين ألفا لكل لتر من الثقافة.

ثم قم بتخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتنقية CENP-F ، قم أولا بإذابة الخلايا باستخدام بنية CENP-F. ثم اضبط مستوى الصوت على 20 مل باستخدام مخزن مؤقت ملزم لضريبة السلع والخدمات.

بمجرد ضبط الحجم ، أضف جميع المختزلات ومثبطات الإنزيم البروتيني واحدة تلو الأخرى لإعداد تعليق الخلية للتحلل اللاحق. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية في دورق زجاجي واغمر الدورق في حمام ماء مثلج. ثم صوتنة الثقافة.

بعد الصوتنة ، أضف 250 ميكرومولار PMSF إلى المحللة ، ثم افحص المحللة ، والتي يجب أن تكون شفافة في هذه المرحلة. ثم قم بالطرد المركزي للمحللة عند 12 ، 000 إلى 40 ، 000 مرة جم لمدة 25 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد العمود بإضافة ملليلترين من الجلوتاثيون ، الملاط ، واحد إلى واحد إلى عمود كروماتوغرافيا يمكن التخلص منه.

لموازنة العمود ، اغسله أولا ب 25 مل من الماء النقي للغاية ثم 25 مل من مخزن تخزين ضريبة السلع والخدمات. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال حجم صب 0.2 ميكرومتر. بعد ذلك ، صب المحللة على العمود المتصل لخطوة الربط.

قم بتغطية العمود واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع الجوز برفق وتجنب الرغوة. بعد 30 دقيقة ، انقل العمود على الرف واترك الراتنج يستقر. ثم اجمع التدفق واغسل العمود مرتين ب 25 مل من مخزن تخزين ضريبة السلع والخدمات.

بمجرد اكتمال الغسيل ، قم بتوصيل العمود مرة أخرى. ثم أضف 400 ميكرولتر من مخزن مؤقت لربط ضريبة السلع والخدمات و 250 ميكرولتر من مخزون البروتياز PS بنشاط 1000 وحدة لكل مليغرام إلى العمود. قم بتغطية العمود مرة أخرى وقم بتدوير العمود برفق لإعادة تعليق الراتنج في المخزن المؤقت ، ثم احتضان العمود عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة.

بعد انتهاء فترة الحضانة ، أضف أربعة ملليلتر من مخزن مؤقت لربط ضريبة السلع والخدمات لتصفية جزء CENP-F من العمود الذي تم شقه بشكل بروتيني. بجانب حذف علامة ضريبة السلع والخدمات مرة أخرى ، قم بتوصيل العمود. ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول شطف ضريبة السلع والخدمات الذي يحتوي على الجلوتاثيون إلى العمود.

بعد ذلك ، احتضن العمود لمدة 10 دقائق لإزالة علامة ضريبة السلع والخدمات المقيدة. بعد 10 دقائق اجمع التميء. ثم قم بإجراء الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS لتحليل أجزاء شطف البروتياز PS والجلوتاثيون.

بجانب تركيز عينة البروتين ، قم بإزالة ماصة بروتياز PS في المقصورة العلوية لوحدة مرشح الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي بمقدار ثلاثة كيلو دالتون. ثم قم بالطرد المركزي للشطف بمقدار 4 ، 100 مرة G بزيادات من 10 إلى 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في دوار متأرجح للخارج ، لتركيز العينة. بعد كل زيادة ، اخلطي عينة البروتين في مرشح التركيز عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل لتجنب تكوين تدرج تركيز.

لتنقية CENP-F عن طريق ترشيح الهلام ، قم بإرفاق عمود ترشيح الهلام بنظام كروماتوغرافيا سائل سريع للبروتين. بعد ذلك ، قم بموازنة العمود بحجم عمود واحد من المخزن المؤقت لترشيح الجل. بعد ذلك ، قم بعمل جهاز طرد مركزي لجزء CENP-F في أنبوب طرد مركزي دقيق عند 21 ، 700 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد انتهاء الطرد المركزي ، قم بحقن العينة على العمود ، ثم قم بمسح العمود بمخزن مؤقت لترشيح الهلام واجمع 0.6 مليلتر من جزء CENP-F. بعد ذلك ، قم بتحليل ملف تعريف ترشيح الهلام وقم بتشغيل SDS-PAGE لكسور الذروة. كسور التجمع التي تحتوي على CENP-F النقي.

ثم ركز جزء CENP-F المنقى إلى 3.3 ملليغرام لكل مليلتر. لتحديد تركيز البروتين ، قم بتخفيف جزء CENP-F بنسبة واحد إلى 100 بماء فائق النقاء. بعد ذلك ، سجل الطيف من 220 إلى 300 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي.

بعد ذلك ، قم بإعداد كميات من 50 ميكرولترا من CENP-F المنقى في أنابيب دقيقة سعة 0.5 مليلتر ، ثم قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بالنسبة لمقايسة الكيناز ، امزج جزء CENP-F مع ATP و CDK1 cyclin B جنبا إلى جنب مع المخازن المؤقتة الأخرى في أنبوب دقيق سعة 0.5 ملليلتر. ثم قم بإعداد عينة ثانية بدون CDK1 cyclin B كعنصر تحكم سلبي.

ثم احتضان العينات في حمام مائي عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة إلى 16 ساعة. من أجل التحديد الناجح لمواقع الفسفرة عن طريق قياس الطيف الكتلي ، من الأهمية بمكان أن تكون كفاءة الفسفرة عالية قدر الإمكان ، ويفضل أن تكون 100٪ لزيادة كفاءة الفسفرة ، أضف المزيد من الكيناز وزيادة وقت الحضانة إلى 16 ساعة. ثم أضف كميات متساوية من محلول هيدروكلوريد غوانيدين ستة مولار إلى تفاعل فحص كيناز المتبقي والتحكم السلبي وإجراء قياس الطيف الكتلي لتحديد موقع الفسفرة.

للحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي عالية الجودة ، من المهم أيضا أن تكون عينة البروتين المنقى نقية ومتجانسة للغاية. يتم إجراء تحليل SDS-PAGE الأول والذي يظهر تحولا تصاعديا واضحا للنطاق على الجل ل ل CENP-F الفسفوري مقارنة بالتحكم السلبي بدون CDK1 ، مما يشير إلى أن cNLS من CENP-F هي ركيزة CDK1. بعد ذلك ، يتم إجراء قياس الطيف الكتلي لتحليل عدد وكفاءة مواقع الفسفرة CENP-F.

يظهر الطيف الكتلي لمصيدة الأيونات ESI ل CENP-F السليم في المختبر الفسفورة أن هناك خمس قمم ، تشير إلى أربعة مواقع للفسفرة والذروة الخامسة هي البروتين غير الفسفري. بعد ذلك ، يوضح ملف تعريف شطف استبعاد الحجم هذا أن حجم الشطف لذروة كاريوفيرين ألفا يتحول إلى كتلة أعلى عند إضافة النوع البري CENP-F ، والذي لم يتم ملاحظته عند إضافة طفرة CENP-F. يشير هذا إلى أن الإصدار الفوسفوميمي S3048D من CENP-F يضعف تفاعل CENP-F cNLS مع karyopherin alpha.

أخيرا ، يظهر تحليل SDS-PAGE الذي تم إجراؤه أن الجزء البري من النوع البري CENP-F مع cNLS السليم يتزاحم مع كاريوفيرين ألفا ، مما يشير إلى تفاعل قوي. ومع ذلك ، فإن S3048D المتحولة من CENP-F و karyopherin alpha تتخلص في قمم منفصلة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من مواقع الفسفرة التي تم الحصول عليها مقابل تسلسل الفسفرة الإجماعي CDK1 والتحقق من أن الركيزة المحددة يتم توطينها في نفس الحجرة الخلوية مثل CDK1.

بعد هذا الإجراء ، يجب إجراء التحقق الوظيفي في الخلايا أو النماذج الحيوانية للتأكد من أن مواقع الفسفرة المحددة لها وظيفة فسيولوجية. يتوفر عدد من الأدوات للتحقق الوظيفي مثل مثبطات CDK1 المحددة والطفرات الفوسفورية. نظرا للعدد الكبير من ركائز CDK1 في البروتيوم ، لا يزال يتعين اكتشاف العديد من ركائز CDK1 البشرية وسيكون اختبار كيناز في المختبر أداة مهمة لتحديد هذه المواقع ورسم خرائط لها والتحقق منها.

تحديد مواقع الفسفرة هذه إجراء دراسات ميكانيكية لكيفية تحكم CDK1 في دورة الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مواقع الفسفرة المحددة ل CDK1 والبروتينات المستهدفة عن طريق اختبار كيناز في المختبر.