وهناك طريقة لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة ضد كيناز مثبطات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الطفرات المقاومة للأدوية والتحقق من صحتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء مكتبة طفرات عشوائية للجين الورمي المستهدف أولا. الخطوة الثانية هي إجراء الفحص في المختبر لظهور المستنسخة المقاومة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تسلسل المستنسخة المقاومة لتحديد الطفرات المقاومة. تتمثل الخطوة الأخيرة في التحقق من صحة الطفرات المقاومة عن طريق إعادة إنشاء الطفرات باستخدام الطفرات الموجهة للموقع ، متبوعة بفحوصات في المختبر وفي الجسم الحي. في نهاية المطاف ، يمكن تحديد الطفرات المقاومة للأدوية ذات الصلة سريريا مقابل زوج مستهدف من الأدوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الطرق القائمة على ENU أو PCR هي أنها غير متحيزة وعلى عكس METAGENE ssis المستند إلى PCR ، فإن هذه التقنية لا تقتصر على حجم الجين الورمي أو محتوى GC لأي جين. بشكل عام ، سيكافح أولئك الجدد في هذه التقنية بسبب نقص المعرفة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية.

حيث يصعب تعلم خطوات التكوين والغرب. ذلك لأن الكثير من الناس يفتقرون إلى الخبرة في إنتاج الفيروسات ، في زراعة الخلايا والوسائط شبه الخلوية. يبدأ هذا الإجراء بتحويل XL واحدة من خلايا القولونية الحمراء مع بلازميد يحمل JAK اثنين V 617 f شكل إسوي مسرطن من JAK اثنين XL واحد أحمر ه القولونية معيبة في آليات إصلاح الحمض النووي ، مما يسمح لها بدمج طفرات عشوائية أثناء النسخ المتماثل.

امزج 50 إلى 100 نانوجرام من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في أنبوب بولي بروبيلين مبرد مسبقا. لا تستخدم أكثر من 100 نانوجرام من الحمض النووي لأنها تقلل من كفاءة التحول. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة ، مع التدوين برفق كل خمس دقائق للحصول على تغطية جيدة للمكتبة.

استخدم أربعة إلى ستة أنابيب من الخلايا المختصة. اغمر أنابيب البولي بروبلين في حمام مائي عند 42 درجة مئوية لصدمة حرارية لمدة 45 ثانية ، ثم احتضن على الثلج لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسيط SOC إلى كل أنبوب.

احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز بسرعة 225 إلى 250 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. خلايا صفيحة على أربع ألواح مثقاب رطل 10 سم تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة.

بمجرد ظهور المستعمرات ، اجمعها عن طريق كشط الألواح باستخدام مكشطة صفيحة معقمة. اجمع الخلايا من كل لوحة. بعد ذلك ، يتم عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد التجارية ويتم تقييم عدم تجانس الطفرات في المكتبة عن طريق التسلسل قبل يوم واحد من لوحة التعدي ، أربعة مرات 10 إلى خلايا HEK 2 93 T السادسة ، على أطباق 100 ملم في DM EM تحتوي على 10٪ FCS ، والبنسلين ، والستربتومايسين ، واثنين من المليمولار L-glutamine.

في اليوم التالي ، قم بإعداد كواشف الإرسال لكل طبق 100 ملم. امزج خمسة ميكروغرامات من مكتبة البلازميد وخمسة ميكروغرامات من بلازميد عبوة الفيروسات القهقرية و 40 ميكرولترا من جين FU بحجم إجمالي يبلغ 400 ميكرولتر باستخدام وسائط DM E EM الخالية من المصل. احتضان مزيج الحمض النووي والدهون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، استبدل وسط خلايا HEK 2 93 T بوسط جديد وأضف مركب دهون الحمض النووي بالتنقيط فوق الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. بعد ست ساعات ، استبدل وسائط التعدين بوسائط جديدة واحتضان الألواح لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية لكل إنتاج للفيروس.

بعد 48 ساعة من الحضانة ، اجمع المواد الطفية الفيروسية التي تمت تصفيتها من خلال مرشح قرص acro 0.45 ميكرومتر لبدء إجراء الفحص وتحديد JAK المقاومة للأدوية ، واثنين من طفرات V 607 F تنقل BAF ثلاث خلايا مع المواد الطافية الفيروسية القهقرية. امزج 100 مليون BAF ثلاث خلايا مع 100 مل من المواد الطافية للفيروس بحجم إجمالي قدره 300 مل باستخدام وسائط RPMI التي تحتوي على 10٪ مصل ودماغ متعدد قم بتوزيع هذا الخلية والخليط الفائق للفيروس على ستة ألواح آبار متعددة تملأ كل بئر بأربعة إلى خمسة ملليلترات.

بالطرد المركزي للألواح عند 1 ، 250 GS لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في اليوم التالي ، وقم بتجميع الخلايا المنقولة لكل تركيز دواء. امزج 10 ملليلتر من الخلايا مع ركسوليتينيب في أنبوب سعة 50 ملليلترا.

تركيزات ركسوليتينيب التي تم اختبارها في هذا المثال هي 1 و 5 و 2 و 0.5 و 10 ميكرومولار. اصنع الحجم حتى 40 مل باستخدام RPMI الذي يحتوي على 20٪ مصل. أضف 10 ملليلتر من 1.2٪ اوجير إلى الخلايا واخلط اللوحة بعناية في ستة أطباق بئر.

الاستغناء عن أربعة ملليلتر لكل بئر. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. بمجرد ظهور المستعمرات المقاومة، استخدم أطراف ماصة سعة 0.2 ملليلتر لقطف المستعمرات وزراعتها بشكل فردي.

في 24 لوحة بئر لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام ، تحصد ثلاث خلايا مقاومة BAF عن طريق الطرد المركزي عند 450 GS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد عزل الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومية التجارية ، قم بتضخيم JAK اثنين CDNA كامل الطول من الحمض النووي الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم يتم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام في أجار روز ونطاق الحمض النووي 3.4 KILOBASE.

يمثل إطار الطلاء JAK الثاني معزولا باستخدام مجموعة استخراج هلام تجارية. أخيرا ، قم بتسلسل CDNA كامل الطول باستخدام ثمانية بادئات داخلية تمتد عبر تسلسل الترميز وتحليل التسلسلات باستخدام البرامج التجارية للتحقق من صحة الطفرات المقاومة للأدوية. يتم إنشاء المتغيرات المختارة في المختبر عن طريق الطفرات الموجهة للموقع لتسلسل JAK two V 617 F وإعادة إدخالها في خلايا BAF الثلاث.

أضف 50 ميكرولترا من الوسائط التي تحتوي على تركيزات مختلفة من ruxolitinib إلى الآبار عبر اللوحة بشكل منفصل ، اللوحة 10 إلى الرابعة من BAF ثلاث خلايا JAK V 617 F في كل بئر من لوحة 96 بئر تحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 60 ساعة لتقييم صلاحية الخلية ، أضف 10 ميكرولترات من كاشف WST واحد لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. سجل الامتصاص عند 450 باستخدام قارئ لوحة. قم بإجراء جميع المقايسات بثلاث نسخ وارسم متوسط الامتصاص ضد تركيزات ruxolitinib.

قم بإجراء منحنى سيني مناسب بشكل أفضل باستخدام درجة خوارزمية تركيب منحنى غير خطي. يتم إجراء تركيز الدواء الذي ينتج عنه 50٪ من صلاحية الخلية مثل IC 50 الخلوي لاحقا في الجسم الحي للتحقق من صحة الطفرات المقاومة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. نظرا لأن استنساخ الخلايا المقاومة الناتجة عن الطفرات العشوائية قد تحمل أكثر من طفرة واحدة ، يجب التحقق من صحة هذه الطفرات بمعزل عن طريق كل من المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي.

في المقايسة المختبرية ، تم إنشاء المتغيرات المختارة عن طريق الطفرات الموجهة للموقع لتسلسل JAK two V 607 F وأعيد إدخالها في خلايا BAF الثلاث ، والتي تم قياسها بعد ذلك لقدرة تكاثر الخلايا بجرعات مختلفة من ruxolitinib لتقييم قيم IC 50. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء النشاف المناعي للفوسفوتيروزين أو فوسفو ستات خمسة على محللات البروتين لثلاث خلايا BF تم تحضينها بجرعات متزايدة من ركسوليتينيب لاستبعاد أي مقاومة بوساطة غير مستهدفة. وبالتالي ، تم تأكيد أن الطفرات التي تظهر قيم IC 50 المحسنة والفسفرة الذاتية المستمرة بتركيزات أعلى من ruxolitinib هي متغيرات مقاومة للأدوية للتحقق من صحة المقاومة في الجسم الحي.

BF ، ثلاث خلايا مصممة للتعبير عن JAK ، تم حقن اثنين من V وستة متغيرات 17 F وكرز لوسيفيراز في الفئران ، والتي تم حقنها لاحقا ب ruxolitinib لمدة أسبوعين. بعد أسبوعين. تم تصوير الفئران بحثا عن التلألؤ البيولوجي المحفز لوسيفيراز ، وتم تقييم BAF ثلاثة خيميرية في نخاع العظام وتدفق الدم المحيطي عن طريق قياس تألق الخلايا الإيجابية الكرز.

تظهر النتائج أن الفئران التي تعبر عن JAK two V 607 F هي ruxolitinib بينما تظهر المتغيرات المقاومة زيادات تدريجية في التلألؤ البيولوجي خلال فترة العلاج. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التكوين الجديد العشوائي في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير مكتبة بلازميد عشوائية ومكتبة الحمض النووي للفحص في المختبر ضد أي زوج مستهدف للأدوية.

لا تنس أن العمل مع الفيروسات القهقرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.