تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الكينازات التي تفسفر ركيزة ذات أهمية باستخدام طرق فحص عالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا مع البلازميدات التي تعبر عن كينازات FU إلى الجلوتاثيون على شكل ترانسفيراز أو ضريبة السلع والخدمات. الخطوة الثانية هي إجراء سحب GST kinase.

بعد ذلك ، يتم تحميل العينات في المواد الهلامية ، والتي يتم تشغيلها بعد ذلك وتلطيخها بصبغة كوماسي الزرقاء الرائعة. الخطوة الأخيرة هي تجفيف المواد الهلامية وتعريضها لفيلم التصوير الشعاعي التلقائي. في النهاية ، من خلال تطوير وتفسير الأفلام الناتجة ، يمكن للمرء تحديد أزواج ركيزة كيناز لأن كل ممر يمثل مقايسة كيناز مميزة.

تشمل الطرق الحالية لتحديد كيناز لركيزة مفسفرة معروفة استخدام مناهج المعلوماتية الحيوية للبحث عن موقع إجماع في الركيزة ، والكشف عن المجمعات بين الكيناز والركائز باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية ونهج التجربة والخطأ ، والبحث عن ركائز إجماع كونتي على أساس وظيفتها البيولوجية المعروفة. هذه الأساليب تستغرق وقتا طويلا ولا تحقق النجاح دائما. يسمح نهجنا بالتعرف السريع على أزواج ركيزة كيناز على أساس النتائج الوظيفية.

عندما خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة ، كنا قلقين من عدم وجود خصوصية كافية في المختبر. كما اتضح ، فإن خصوصية الركيزة ممتازة وغالبا ما نجد أن كينازات أفراد الأسرة فقط هي القادرة على فسفرة ركيزة معينة في الشاشة. يتضح هذا بشكل خاص عندما نقوم بتعدد الإرسال باستخدام ركائز متعددة في كل شاشة ، مما يدل على أن الإجراء سيكون كورتني ، فني من مختبري ، ابدأ الإجراء بإعداد الكواشف والألواح والخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص.

إذا تم تجميد الألواح التي تحتوي على بلازميدات كيناز ، قم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي عند 1900 مرة G لمدة ثلاث دقائق لتجميع أي رطوبة في قاع الآبار. امزج 8.6 مل من وسط المصل المختزل مع 312.7 ميكرولتر من كاشف الشفافية القائم على الدهون ، واترك الخليط لمدة خمس دقائق لكل بئر. من 96 صفيحة بئر تحتوي على بلازميدات كيناز عند 10 ميكرولتر من وسط المصل المختزل.

باستخدام موزع سائل آلي مزود بكاسيت صغير الحجم ، ثم أضف 10 ميكرولتر من مزيج كاشف التعداء المتوسط المصل المخفض لكل بئر ، باستخدام موزع سائل آلي مزود بكاسيت صغير الحجم والسماح لللوحة بالجلوس لمدة 20 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك ، يعلق resus 2 93 T خلية عند 0.75 مليون خلية لكل مليلتر في 80 مل من delcos الكامل المعدل يساوي الوسط أو DMEM عند 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر. باستخدام موزع سائل آلي مزود بكاسيت حجم قياسي ، افحص الآبار تحت المجهر بحثا عن توزيع موحد للخلايا قبل إعادة اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

لبدء تجربة سحب كيناز ضريبة السلع والخدمات. اصنع أربعة ملليمولار لكل محلول فانادات عن طريق خلط 60 ميكرولتر من 0.2 مولار فانادات الصوديوم مع 540 ميكرولتر من الماء في أنبوب ثان ، وخلط 2.7 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد و 1.4 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. أضيفي المحاللين معا واتركي الخليط لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.

باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع ميكرولترين من كلوريد الكالسيوم 0.25 مولار في كل بئر ، متبوعا ب 2.5 ميكرولتر من محلول التمر المثبت. احتضن كل طبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم ضعه على الثلج ، مع إبقاء الأطباق على الجليد. قم بإزالة الوسط من كل بئر ، باستخدام فراغ على الفور عند 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول التحلل المثلج.

باستخدام موزع سائل آلي مزود بالكاسيت القياسي ، اترك اللوحة لمدة 30 دقيقة على الثلج حتى يتحول إلى القمل. بعد تدوير الألواح عند 1900 مرة G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية ، اكشط الخلايا من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات وانقل جميع المحتويات إلى vbo المسمى بشكل مناسب. تقوم 96 لوحة بئر بتدوير الألواح عند 1900 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية أثناء ملء الدوران للألواح المطلية بالجلوتاثيون ب 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول التحلل المثلج.

كشطف ، احتفظ بالأطباق على الجليد. بعد الطرد المركزي للألواح السفلية ، اقلب ألواح الجلوتاثيون فوق الحوض لإزالة عازلة التحلل وصمة عار على منشفة ورقية. انقل المخزن المؤقت للتحلل من الألواح السفلية V إلى ألواح الجلوتاثيون عن طريق إمالة اللوحة واستخدام ماصة متعددة القنوات ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الموجودة في الأسفل.

ثم غطي الأطباق واتركيها على الثلج لمدة ساعتين على الأقل. للربط بالقرب من نهاية خطوة الربط التي تستغرق ساعتين ، قم بإعداد محطة عمل للنشاط الإشعاعي لضمان وجود احتياطات السلامة اللازمة للعمل الإشعاعي. اضبط فرن التهجين على 30 درجة مئوية.

اقلب ألواح الجلوتاثيون فوق الحوض للتخلص من عازلة التحلل ولطخها على منشفة ورقية. اشطف الآبار ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من محلول التحلل بدون PMSF. لا تدع الآبار تجف.

احتفظ بها في الشطف حتى تصبح جاهزة للمتابعة. بعد ذلك ، قم بإعداد 55 مل من مخزن مؤقت X kinase أو x kb كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 50 ميكرولترا من واحد × كيلو بايت إلى كل بئر من اللوحة باستخدام موزع سائل آلي مزود بشريط حجم قياسي.

ثم قم بإعداد المحلول A عن طريق عمل محلول يحتوي على الركيزة ذات الأهمية وبروتين المايلين الأساسي أو MVP كما هو مفصل في بروتوكول النص واحدا تلو الآخر. اقلب الألواح فوق الحوض لإزالة قطعة شطف XKB على منشفة ورقية وأضف على الفور 30 ميكرولترا من المحلول أ. احتفظ بالأطباق على الجليد.

بعد ذلك ، قم بإعداد المحلول B في منطقة عمل النشاط الإشعاعي كما هو موضح في بروتوكول النص عند 20 ميكرولتر من المحلول B لكل بئر. باستخدام ماصة مكررة تساعد في الخلط بسبب غطاء قوة الطرد واحتضان اللوحة في فرن تهجين 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، انقل الأطباق مرة أخرى إلى الثلج.

ثم أضف 50 ميكرولترا من اثنين × كبريتات الصوديوم أو محلول تحلل SDS إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. وينبغي أن تنفذ جميع الأعمال في هذا القسم في منطقة مخصصة للنشاط الراديوي. قم بتشغيل فرن التهجين واضبطه على 85 درجة مئوية.

بمجرد وصول الفرن إلى درجة الحرارة ، انقل الأطباق إلى الفرن واحتضانها لمدة 10 دقائق لتشويه العينات. التحميل التالي. 26 مادة هلامية مسبقة الصب جيدا مع 15 ميكرولتر من كل تفاعل.

باستخدام ماصة متعددة القنوات لملء عدة آبار في وقت واحد ، يجب توخي الحذر من أن تتماشى جميع الأطراف مع الآبار المقابلة. قبل إضافة العينات ، قم بتشغيل الجل عند 150 فولت. لا تدع الخط الأزرق ينفجر من قاع الجل لأن هذا يحتوي على A TP غير مدمج. ثم قم بتفكيك المواد الهلامية وإزالة TP غير المدمجة لأنها ستؤدي إلى تغميق التعرض للهلام على الأفلام.

ضع المواد الهلامية في حاويات تحمل علامات وقم بتغطيتها بصبغة كوماسي لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة وصمة عار كوماسي. اشطف المواد الهلامية لفترة وجيزة بالماء وأضف محلول احتجاز.

احتجز المواد الهلامية حتى تظهر البروتينات بوضوح. يجب أن يكون نطاق MVP وشريط للركيزة مرئيا لكل عينة. لتجفيف المواد الهلامية ، قم بقص ورقة كبيرة من ورق الترشيح وضعها على المجفف.

بلل ورقة السيلوفان في الماء المقطر حتى تصبح ناعمة وخالية من التجاعيد وضعها فوق الورق. ضع المواد الهلامية فوق ورقة السيلوفان مع تدوين ترتيب المواد الهلامية. بلل ورقة السيلوفان الثانية وضعها فوق المواد الهلامية.

افردي جميع الفقاعات للحصول على سطح موحد لطيف. أغلق الغطاء ، وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية وقم بتشغيل المواد الهلامية لمدة ثلاث ساعات عند 80 درجة مئوية. بمجرد أن تجف المواد الهلامية ، قم بتعريضها لفيلم التصوير الشعاعي التلقائي المستحلب المزدوج باستخدام شاشة لتكثيف الإشارة.

لف الكاسيت بغلاف الساران أو كيس بلاستيكي وأغلقه بشريط لاصق لمنع الصقيع قبل تخزين الكاسيت عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. في اليوم التالي ، أخرج الكاسيت من الفريزر واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة. قم بتطوير الفيلم في غرفة مظلمة باستخدام معالج الأفلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة الموضحة.

فيما يلي نتائج تمثيلية من شاشة تم فحص 180 كيناز باستخدام ركيزة الببتيد الموسومة بضريبة السلع والخدمات المقابلة للأحماض الأمينية من 268 إلى 283 من منشط النسخ المنظم من kreb two أو C RTC two ، بالإضافة إلى بروتين المايلين الأساسي لفحص كيناز الكلاسيكي أو MBP اثنين فقط. كيناز يعلم اثنان والكيناز وثيقة جدا, علامة ثلاثة فسفرة. يتم تضمين CRTC اثنين من الببتيد MBP كعنصر تحكم داخلي في جميع المقايسات لأنه يحتوي على العديد من المخلفات ذات الصلة بالفوسفوريل ويمتد بسرعة 18 كيلودالتون باتجاه الجزء السفلي من الجل.

هذا يسمح بتفسير الخصوصية. بعض الكينازات سوف فسفرة الركيزة بقوة و MVP. وتجدر الإشارة هنا إلى أن الآبار التي تحتوي على ضريبة السلع والخدمات وحدها تنقي دائما بعض نشاط الكيناز الداخلي.

وبالتالي ، هناك دائما فسفرة في الخلفية في الفحص. في حين أن هذا لا يستبعد أن تكون فسفرة الركيزة حقيقية ، إلا أنه يشير إلى أنه في الإعداد المختبري ، قد يكون كيناز أقل انتقائية. من المفيد بشكل خاص تضمين ركائز متعددة ذات أوزان جزيئية مختلفة لاستخلاص استنتاجات بشأن خصوصية ركيزة كيناز.

نظرا لأن الشاشة في المختبر وتحدث مستويات إضافية من التعقيد في الجسم الحي ، يجب التحقق من صحة كيناز المرشح في الخلايا. على سبيل المثال ، قد يكون لدى كيناز المرشح القدرة على فسفرة الركيزة في المختبر ، ولا يتم التعبير عنها في نفس نوع الخلية أو في نفس الخلايا الفرعية للحجرة مثل الركيزة. يتم ذلك عادة باستخدام إسكات المرشح بوساطة RNAi.

من الممكن أيضا إجراء شاشة ثانوية باستخدام طفرة غير مرتبطة بالفوسفوريل للركيزة لتأكيد الخصوصية.