تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الكينازات التي تقوم بفسفرة ركيزة معينة باستخدام طرق الفرز عالي الإنتاجية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن الخلايا ببلزميدات تعبر عن كينازات مدمجة مع الغلوتاثيون إس-ترانسفيراز أو GST. والخطوة الثانية هي إجراء سحب الكيناز بواسطة GST.

بعد ذلك، يتم تحميل العينات في هلامات (gels)، والتي يتم تشغيلها بعد ذلك وصبغها بصبغة Coomassie brilliant blue. وتتمثل الخطوة النهائية في تجفيف الهلامات وتعريضها لفيلم التصوير الشعاعي الذاتي (autoradiography film). وفي النهاية، من خلال تحميض وتفسير الأفلام الناتجة، يمكن تحديد أزواج الكيناز والركيزة (kinase substrate pairs)، حيث يمثل كل مسار مقايسة كيناز متميزة.

تتضمن الطرق الحالية لتحديد الكيناز الخاص بركيزة مفسفرة معروفة استخدام مناهج المعلوماتية الحيوية للبحث عن موقع إجماع في الركيزة، والكشف عن المعقدات بين الكيناز والركائز باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية ومنهج التجربة والخطأ، والبحث عن ركائز الإجماع بناءً على وظيفتها البيولوجية المعروفة. وتستغرق هذه المناهج وقتاً طويلاً ولا تكلل دائماً بالنجاح. يتيح منهجنا التحديد السريع لأزواج الكيناز والركيزة بناءً على النتائج الوظيفية.

عندما خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة، كنا قلقين من احتمالية عدم وجود نوعية كافية في المختبر. ولكن تبين أن نوعية الركيزة ممتازة، وغالباً ما نجد أن كينازات العائلة نفسها هي فقط القادرة على فسفرة ركيزة معينة في الفحص. ويتضح هذا بشكل خاص عندما نقوم بإجراء فحص متعدد باستخدام ركائز متعددة في كل عملية فحص، مما يثبت كفاءة الإجراء. ستقوم كورتني، وهي فنية من مختبري، ببدء الإجراء بتحضير الكواشف والأطباق والخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي.

إذا كانت الأطباق التي تحتوي على بلازميدات الكيناز (kinase plasmids) مجمدة، تُذاب في درجة حرارة الغرفة وتُطرد مركزياً عند 1900 ×g لمدة ثلاث دقائق لتجميع أي رطوبة في قاع الآبار. اخلط 8.6 milliliters من وسط غذائي منخفض المصل مع 312.7 µL من كاشف ترانسفكشن (transfection) قاعدي الدهون، واترك الخليط لمدة خمس دقائق. أضف 10 µL من الوسط الغذائي منخفض المصل إلى كل بئر من آبار الطبق المكون من 96 بئراً والذي يحتوي على بلازميدات الكيناز.

باستخدام موزع سوائل آلي مجهز بكاسيت للأحجام الصغيرة، يتم إضافة 10 µL من خليط كاشف ترانسفكشن الوسط المصلي المختزل لكل بئر، ثم تُترك الصفيحة لمدة تتراوح من 20 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق خلايا 2 93 T بتركيز 0.75 مليون خلية لكل mL في 80 mL من وسط DMEM المعدل والكامل، وبمعدل 100 µL من معلق الخلايا لكل بئر. وباستخدام موزع سوائل آلي مجهز بكاسيت للأحجام القياسية، يتم فحص الآبار تحت المجهر للتأكد من توزيع الخلايا بشكل متجانس قبل إعادة الصفيحة إلى حضانة بدرجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة.

لبدء تجربة سحب كيناز GST، يتم تحضير محلول فانادات بتركيز 4 mM عن طريق خلط 60 µL من فانادات الصوديوم بتركيز 0.2 M مع 540 µL من الماء. وفي أنبوب ثانٍ، اخلط 2.7 µL من بيروكسيد بتركيز 30% مع 1.4 mL من المحلول الملحي الموقوت بالفوسفات أو PBS. أضف المحلولين معاً واترك الخليط لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 2 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.25 molar في كل بئر، يليه 2.5 µL من محلول التاريخ المثبت. يتم تحضين كل لوحة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق، ثم توضع على الثلج مع الحفاظ على اللوحات مبردة. قم بإزالة الوسط من كل بئر باستخدام الشفط الفراغي، وأضف فوراً 50 µL من منظم التحلل (lysis buffer) المبرد بالثلج لكل بئر.

باستخدام موزع سوائل آلي مزود بالكاسيت القياسي، اترك الطبق لمدة 30 دقيقة على الثلج للتحلل. بعد طرد الطباق بسرعة 1900 ×g لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C، قم بكشط الخلايا من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات وانقل جميع المحتويات إلى أنابيب vbo مصنفة بشكل مناسب. بالنسبة لأطباق 96 بئراً، قم بطرد الأطباق بسرعة 1900 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، وأثناء عملية الطرد، املأ الأطباق المطلية بالجلوتاثيون بـ 100 µL لكل بئر من منظم التحلل المبرد بالثلج.

كإجراء للشطف، يُحفظ في plates على الثلج. بعد عملية الطرد المركزي لـ plates السفلية، تُقلب glutathione plates فوق حوض لرج وإفراغ lysis buffer ثم تُجفف باستخدام مناديل ورقية. يتم نقل lysis buffer من V bottom plates إلى glutathione plates عن طريق إمالة plate واستخدام multi-channel pipette، مع الحرص على عدم تعكير pellet الموجود في القاع.

بعد ذلك، قم بتغطية الأطباق واتركها في الثلج لمدة ساعتين على الأقل. وبدايةً من نهاية خطوة الربط التي تستغرق ساعتين، قم بتجهيز محطة عمل النشاط الإشعاعي مع ضمان اتخاذ احتياطات السلامة اللازمة للتعامل مع المواد المشعة. اضبط فرن التهجين على درجة حرارة 30 درجة Celsius.

اقلب أطباق الجلوتاثيون فوق حوض لرج وإخراج منظم التحلل (lysis buffer)، ثم جففها باستخدام مناديل ورقية. اشطف الآبار ثلاث مرات بـ 100 µL من منظم التحلل الخالي من PMSF. تجنب ترك الآبار تجف.

اتركها في سائل الشطف حتى يحين وقت المتابعة. بعد ذلك، قم بتحضير 55 milliliters من منظم الكيناز بتركيز 1X أو 1x kb كما هو موضح في البروتوكول النصي. أضف 50 microliters من 1x kb إلى كل بئر من آبار اللوحة باستخدام موزع سوائل آلي مزود بكاسيت حجم قياسي.

بعد ذلك، قم بتحضير المحلول A عن طريق تحضير محلول يحتوي على الركيزة المعنية وبروتين المايلين الأساسي (myelin basic protein) أو MVP كما هو مفصل في البروتوكول النصي، كل منهما على حدة. اقلب الأطباق فوق حوض الغسيل لإزالة شطف 1XKB على منشفة ورقية، ثم أضف فوراً 30 µl من المحلول A باستخدام موزع سوائل آلي مزود بكاسيت للأحجام الصغيرة. احتفظ بالأطباق على الثلج.

بعد ذلك، قم بتحضير المحلول B في منطقة العمل الخاصة بالنشاط الإشعاعي كما هو موضح في البروتوكول النصي، بمعدل 20 microliters من المحلول B لكل بئر. وباستخدام ماصة تكرارية (repeater pipette)، والتي تساعد في عملية الخلط بفضل قوة القذف، قم بتغطية اللوحة وحضنها في فرن تهجين عند درجة حرارة 30 degree Celsius لمدة 30 دقيقة. وبعد مرور 30 دقيقة، انقل اللوحات مرة أخرى إلى الثلج.

بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول التحلل sodium dodecyl sulfate (SDS) بتركيز 2x إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. يجب تنفيذ جميع الأعمال في هذا القسم في منطقة مخصصة للنشاط الإشعاعي. قم بتشغيل فرن التهجين واضبط درجة حرارته على 85 °C.

بمجرد وصول الفرن إلى درجة الحرارة المطلوبة، انقل الأطباق إلى الفرن وحضنها لمدة 10 دقائق لمسخ العينات. بعد ذلك، قم بتحميل هلامات مسبقة الصب ذات 26 بئراً بـ 15 µL من كل تفاعل.

عند استخدام ماصة متعددة القنوات لملء عدة آبار في وقت واحد، يجب توخي الحذر لضمان محاذاة جميع الرؤوس مع الآبار المقابلة لها. قبل إضافة العينات، قم بتشغيل الهلام عند 150 فولت. لا تسمح للخط الأزرق بالخروج من أسفل الهلام لأن هذا الخط يحتوي على ATP غير المدمج. ثم قم بتفكيك الهلام وإزالة ATP غير المدمج لأنه سيؤدي إلى تعتيم تعريض الهلام على الأفلام.

ضع الهلامات في حاويات مُصنفة وقم بتغطيتها بصبغة Coomassie لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة صبغة Coomassie. اشطف الهلامات سريعاً بالماء وأضف محلول إزالة الصبغة.

اترك الهلامات حتى تصبح البروتينات مرئية بوضوح. يجب أن تظهر حزمة لبروتين MVP وحزمة للمادة الخاضعة للتفاعل لكل عينة. ولتجفيف الهلامات، قص ورقة كبيرة من ورق الترشيح وضعها على المجفف.

قم بترطيب ورقة سيلوفان بالماء المقطر حتى تصبح ملساء وخالية من التجاعيد، ثم ضعها فوق الورقة. ضع الهلامات فوق ورقة السيلوفان مع تدوين ترتيب هذه الهلامات. قم بترطيب ورقة سيلوفان ثانية وضعها فوق الهلامات.

قم بإزالة جميع الفقاعات للحصول على سطح موحد وناعم. أغلق الغطاء، وقم بتشغيل جهاز التفريغ الهوائي وجفف الهلام لمدة ثلاث ساعات عند 80 درجة مئوية. وبمجرد جفاف الهلام، قم بتعريضه لفيلم التصوير الشعاعي الذاتي مزدوج الاستحلاب باستخدام شاشة لتقوية الإشارة.

لف الكاسيت بغلاف ساران أو كيس بلاستيكي وأحكم إغلاقه بالشريط اللاصق لمنع وصول الصقيع قبل تخزين الكاسيت عند درجة حرارة -80 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، أخرج الكاسيت من المجمد واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميض الفيلم في غرفة مظلمة باستخدام جهاز معالجة الأفلام وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة الموضحة.

فيما يلي نتائج ممثلة لعملية فحص تم فيها فحص 180 كيناز باستخدام ركيزة ببتيدية مُوسومة بـ GST تقابل الأحماض الأمينية من 268 إلى 283 من المساعد المنشط للنسخ المنظم بـ kreb اثنين أو CRTC2، بالإضافة إلى ركيزة مقايسة الكيناز التقليدية، البروتين الأساسي للميالين أو MBP. وقد قام كينازان فقط، وهما mark2 والكيناز المرتبط به وثيقاً mark3، بفسفرة ببتيد CRTC2. تم إدراج MBP كضابط داخلي في جميع المقايسات لأنه يحتوي على العديد من الثمالات القابلة للفسفرة ويظهر عند 18 kilodaltons باتجاه أسفل الهلام.

يتيح ذلك تفسير مدى النوعية. فبعض الكينازات ستقوم بفسفرة الركيزة وMVP بقوة. ومن الجدير بالذكر هنا أن الآبار التي تحتوي على GST وحده تعمل دائماً على تنقية بعض نشاط الكيناز الداخلي.

وبالتالي، هناك دائمًا فسفرة خلفية في المقايسة. وبالرغم من أن هذا لا يستبعد كون فسفرة الركيزة حقيقية، إلا أنه يشير إلى أن الكيناز قد يكون أقل انتقائية في الظروف المختبرية. ومن المفيد بشكل خاص تضمين ركائز متعددة ذات أوزان جزيئية مختلفة لاستخلاص استنتاجات تتعلق بخصوصية ركيزة الكيناز.

بما أن عملية الفرز تتم في المختبر (in vitro) وتوجد مستويات إضافية من التعقيد داخل الكائن الحي (in vivo)، يجب التحقق من صحة الكيناز المرشح في الخلايا. فعلى سبيل المثال، قد يمتلك الكيناز المرشح القدرة على فسفرة ركيزة ما في المختبر (in vitro)، ولكن قد لا يتم التعبير عنه في نفس نوع الخلية أو في نفس الخلايا الفرعية للمقصورة التي توجد بها الركيزة. ويتم ذلك عادةً باستخدام الإسكات الجيني بوساطة تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNAi) للكيناز المرشح.

من الممكن أيضاً إجراء فحص ثانوي باستخدام طفرة من الركيزة غير قابلة للفسفرة لتأكيد النوعية.