استخدام إنتاجية عالية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أغشية حيوية من لويحة الأسنان مكونة من أنواع متعددة وتمثيلية من حيث التركيب. ولتحقيق ذلك لغرض التحليل بالتوازي، يتم أولاً تحضير وسط غذائي ولقاح تمثيليين. بعد ذلك، يتم إدخال اللقاح إلى الشريحة الموائعية الدقيقة، وبعد حضانة ليلة كاملة، يتشكل الغشاء الحيوي داخل القناة الدقيقة.

أخيراً، يتم غسل الغشاء الحيوي وصبغه من أجل الفحص المجهري الموضعي باستخدام المجهر المسحي الليزري البؤري أو مجهر الفلورة فوق البؤرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل خلايا التدفق في كونها نظاماً عالي الإنتاجية يسمح بإجراء تجارب متعددة بالتوازي مع استخدام مواد أقل وعدم الحاجة إلى أوساط مختبرية اصطناعية. وللبدء، يتم جمع عينات اللعاب من مجموعة تتكون من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية فردية سعة 50 milliliter.

انقل عينات اللعاب إلى بيكر بلاستيكي واحد موضوع على الثلج. تجنب استخدام البيكرات الزجاجية في هذه العملية لأن البوليمرات الحيوية الموجودة في اللعاب تميل إلى الالتصاق بالأسطح الزجاجية. بعد ذلك، أضف di thio threes hole إلى العينة حتى يصبح تركيزها النهائي 2.5 millimolar.

قم بتقليب الخليط لمدة 10 minutes على الثلج. ثم انقل كافة المحتويات إلى عدة أنابيب بلاستيكية. وأجرِ عملية طرد مركزي سريعة لمدة 30 minutes في جهاز طرد مركزي مبرد عند درجة حرارة 4 °C لفصل الجسيمات عن العينة.

انقل الطور اللعابي إلى وعاء معقم وجديد، وتخلص من جزء الراسب لتحضير وسط نمو خالٍ من البكتيريا من العينة. أولاً، خفف العينة الخالية من الحطام الخلوي باستخدام ثلاثة أحجام من الماء منزوع الأيونات. ثم استخدم مرشح غشائي بمسامية 0.22 micro ومنخفض الارتباط بالبروتين.

قم بتعقيم اللعاب مع الحفاظ على الجزء المفلتر مبرداً على الثلج. قم بنقل المحلول المعقم وتخزينه عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى وقت الحاجة إليه. اجمع عينات اللعاب من مجموعة مكونة من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية معقمة سعة 50 milliliter.

اسحب عينات اللعاب إلى بيكر بلاستيكي معقم مسبقاً في درجة حرارة الغرفة، أو أنبوب سعة 50 milliliter. أضف الجلسرول المعقم حتى يتم الوصول إلى خليط يتكون من 25%glycerol و 75%saliva.

على عكس بروتوكول وسط النمو حيث تمت إزالة الملوثات من خلال خطوة الترشيح، تعد التقنية المعقمة مهمة هنا لمنع التلوث من البكتيريا أو الفطريات غير المحددة للفم. اخلط محلول الساليفا والجليسيرول. قم بتقسيم خليط الساليفا والجليسيرول بدقة إلى حصص متساوية وخزن العينات عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين موعد البدء في استخدامها.

قم بشراء أو تصنيع شريحة مائعية دقيقة تحتوي على قناة دقيقة مماثلة لتلك الموضحة هنا، وذلك قبل تلقيح العينات في الشريحة الدقيقة لكل من وسط النمو الخالي من البكتيريا واللقاح البكتيري الإيجابي على منضدة المختبر في درجة حرارة الغرفة. استخدم جهاز الـ Vortex لكل أنبوب لمدة خمس ثوانٍ للمزج قبل الانتقال إلى التجربة الرئيسية، وابدأ بإضافة 100 µL من وسط النمو عند خزان المخرج في الشرائح الدقيقة. وباستخدام مضخة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر، ابدأ بتدفق قص وسط النمو عبر القناة الدقيقة لمدة دقيقتين.

عند درجة حرارة الغرفة، افحص كل قناة بصرياً للتأكد من امتلاء السوائل بشكل صحيح. حضّن الرقاقة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة؛ حيث سيؤدي ذلك إلى تغليف الجدران الجانبية للقناة الدقيقة بسقالة من البوليمر الحيوي التي سيرتكز عليها الغشاء الحيوي أثناء النمو.

بعد ذلك، اسحب يدوياً ما تبقى من الوسط من خزان المخرج وانقل هذا الجزء، الذي سيعمل الآن كحمل موازنة هيدروديناميكي، إلى خزان المدخل. وبعد ترسيب السقالة البوليمرية الحيوية، أضف 100 µL من اللقاح البكتيري الإيجابي إلى خزان المخرج. ضع الشريحة الدقيقة على لوح تسخين بدرجة حرارة 37 °C وابدأ تدفق عكسي بقص متوسط.

يتم تحريك السائل من المخرج إلى خزان المدخل لمدة ست ثوانٍ بالضبط. بعد ذلك، يتم إيقاف تشغيل المضخة وتحضين الشريحة تحت ظروف ساكنة عند 37 degrees Celsius لمدة 40 دقيقة لتسهيل التصاق البكتيريا أو الفطريات بالجدران الجانبية للقناة الدقيقة. بعد ذلك، يتم إزالة جميع اللقاحات من خزان المخرج والتخلص منها باستخدام ماصة، ثم إعادة ملء الخزان نفسه بإضافة 1 mL من وسط نمو خالٍ من البكتيريا.

يتم تحضين الرقاقة الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة تقريباً تحت تدفق منخفض الإجهاد لتعزيز نمو الغشاء الحيوي الرقيق داخل القناة بعد النمو طوال الليل. اسحب جميع المحاليل من خزاني المدخل والمخرج باستخدام الماصة. ضع 100 µL من PBS في خزان المدخل واغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة.

تحت تدفق أمامي منخفض القص من المدخل إلى المخرج، يصبح الغشاء الحيوي الآن جاهزاً لصبغ الخلايا الحية والميتة. مباشرة قبل صبغ الغشاء الحيوي، قم بتحضير 100 µL من مزيج صبغ الحيوية كما هو موضح في البروتوكول النصي لكل قناة سيتم صبغها. احمِ هذا المحلول من التعرض للضوء حتى يحين وقت استخدامه لصبغ الغشاء الحيوي، ثم اشفط جميع السوائل المتبقية من المدخل وأعد ملء الخزان نفسه بـ 100 µL من مزيج صبغ الحيوية.

ثم ادفع محلول الصبغ عبر القناة الدقيقة لمدة 45 دقيقة. وتحت تدفق منخفض الإجهاد في درجة حرارة الغرفة، تأكد من حماية الشريحة من التعرض للضوء. اشفط جميع السوائل المتبقية من خزان المدخل وأعد ملأه بـ 100 µL من PBS.

اغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة تحت تدفق منخفض الإجهاد في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأصباغ غير المرتبطة الزائدة. أصبح الغشاء الحيوي المصبوغ الآن جاهزاً للفحص بالمجهر الفلوري لتقييم البنية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. ويمكن استخدام عمليات إعادة البناء الرقمية عن طريق إجراء مسحات أفقية باستخدام مجهر بؤري لمشاهدة البنية العامة للغشاء من أي زاوية مائلة.

علاوة على ذلك، يمكن تطبيق تحليل صبغ الخلايا الحية والميتة على مجموعة البيانات نفسها لدراسة الاعتماد المكاني لحيوية الخلايا داخل الغشاء الحيوي كدالة للمعالجات الكيميائية المختلفة. وبمجرد تصوير الغشاء الحيوي، يمكن استخلاص الخلايا من القنوات غير المصبوغة. وباستخدام الماء المقطر الذي يعمل بتدفق قص عالٍ، يمكن حينئذٍ تحديد فلورا الغشاء الحيوي من الحمض النووي الجينومي عن طريق تسلسل 4 5 4 pyro.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل إضافة أنواع أو مركبات مختلفة، للإجابة على تساؤلات متنوعة، مثل ما يحدث للأغشية الحيوية متعددة الأنواع تحت ظروف مختلفة.