استخدام إنتاجية عالية في المختبر نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم
ديسمبر 1, 2014
والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف استخدام نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على الأنواع التي تم تحديدها عادة في الإنسان لوحة الأسنان فوق اللثة. طرق لوصف العمارة بيوفيلم، قابلية بيوفيلم، ونهجا لحصاد بيوفيلم عن التحليلات التي تعتمد على الثقافة أو ثقافة مستقلة وتسليط الضوء عليها.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أغشية حيوية متعددة الأنواع من البلاك الأسنان. بالتوازي مع التحليل ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء وسائط تمثيلية وتلقيح أولا. ثم يتم إدخال اللقاح إلى رقاقة الموائع الدقيقة بعد حضانة ليلية ، ويتشكل غشاء حيوي داخل القناة الدقيقة.
أخيرا ، يتم غسل الأغشية الحيوية وتلطيخها في الموقع لاثنين من المجهري المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر أو الفحص المجهري الفلوري epi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل خلايا التدفق هي أنها نظام إنتاجية عالية يسمح بإجراء تجارب متعددة بالتوازي مع استخدام مواد أقل وعدم الحاجة إلى وسائط معملية اصطناعية. للبدء ، جمع عينات اللعاب من مجموعة من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية فردية سعة 50 مل.
اسحب عينات اللعاب إلى دورق بلاستيكي واحد يوضع على الثلج. تجنب استخدام أكواب الزجاج في هذا الإعداد لأن البوليمرات الحيوية للعاب تميل إلى الالتصاق بالأسطح الزجاجية. بعد ذلك ، أضف ثقب dithio threes إلى العينة حتى يصبح تركيزها النهائي 2.5 مللي مولار.
قلب الخليط لمدة 10 دقائق على الثلج. اسحب جميع المحتويات إلى عدة أنابيب بلاستيكية. قم بإجراء دوران عالي السرعة لمدة 30 دقيقة في جهاز طرد مركزي مبرد بأربع درجات مئوية لفصل الجسيمات عن العينة.
انقل اللعاب إلى وعاء طازج ومعقم وتخلص من جزء الحبيبات لتحضير وسط نمو خال من البكتيريا من العينة. أولا ، قم بتخفيف عينة اليوم الخالية من الحطام بثلاثة أحجام من الماء منزوع الأيونات. ثم باستخدام مرشح غشاء ربط منخفض البروتين 0.22 صغير.
عقم اللعاب مع الحفاظ على الجزء المصفى المبرد على الجليد. بليغ المحلول المعقم وتخزينه على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة. اجمع عينات اللعاب من مجموعة مكونة من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية معقمة سعة 50 ملليلترا.
اسحب عينات اللعاب إلى دورق بلاستيكي معقم مسبقا بدرجة حرارة الغرفة ، أو أنبوب سعة 50 مل. أضف الجلسرين المعقم حتى 25٪ جلسرين. تم الوصول إلى خليط اللعاب بنسبة 75٪.
على عكس بروتوكول وسط النمو حيث تمت إزالة الملوثات بخطوة ترشيح ، فإن التقنية المعقمة مهمة هنا لمنع التلوث من البكتيريا أو الفطريات غير الفموية. اخلطي محلول الجلسرين اللعاب. حسنا ، قم بتخزين خليط الجلسرين اللعاب وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة للبدء.
قم بشراء أو تصنيع شريحة مائع دقيقة ذات قناة دقيقة مماثلة لتلك المبينة هنا قبل تلقيح العينات في الرقاقة لكل من وسط النمو السلبي للبكتيريا واللقاح الإيجابي للبكتيريا على المقعد في درجة حرارة الغرفة. دوامة كل أنبوب لمدة خمس ثوان للخلط قبل الشروع في التجربة الرئيسية ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من وسط النمو في خزان مخرج الرقائق الدقيقة. باستخدام مضخة التحكم بالكمبيوتر ، ابدأ التدفق المتوسط عبر القناة الدقيقة لمدة دقيقتين.
في درجة حرارة الغرفة ، افحص كل قناة بصريا لضمان ملء السوائل بشكل مناسب. احتضن الرقاقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى تغطية الجدران الجانبية للقناة الدقيقة بسقالة بوليمر حيوي يرتكز عليها الأغشية الحيوية أثناء النمو.
ثم قم بسحب الوسائط أو الوسائط المتبقية يدويا من خزان المخرج ونقل هذا الكسر ، والذي سيعمل الآن كحمل موازنة هيدروديناميكي إلى خزان المدخل. بعد ترسيب سقالة البوليمر الحيوي ، أضف 100 ميكرولتر من اللقاح الإيجابي للبكتيريا إلى خزان المخرج. ضع الرقاقة على لوح تسخين 37 درجة مئوية وابدأ التدفق العكسي للقص المتوسط.
السفر من المخرج إلى خزان المدخل لمدة ست ثوان بالضبط. ثم قم بإيقاف تشغيل المضخة واحتضان الشريحة في ظل ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتسهيل ربط البكتيريا أو الفطريات بالجدران الجانبية للقنوات الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة وتخلص من جميع اللقاحات من خزان المخرج باستخدام ماصة وأعد ملء نفس الخزان عن طريق إضافة ملليلتر واحد من وسط النمو الخالي من البكتيريا.
احتضان الرقاقة الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة تقريبا تحت تدفق منخفض لتعزيز نمو الأغشية الحيوية داخل القناة عند النمو بين عشية وضحاها. ماصة جميع المحاليل من كل من خزانات المدخل والمخرج. ضع 100 ميكرولتر من PBS في خزان المدخل واغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
في ظل التدفق الأمامي المنخفض من المدخل إلى المخرج ، أصبح الفيلم الحيوي جاهزا الآن للتلطيخ الحي الميت. قبل تلطيخ الأغشية الحيوية مباشرة ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج تلوين الجدوى كما هو موجود في بروتوكول النص لكل قناة سيتم تلطيخها. قم بحماية هذا المحلول من التعرض للضوء حتى تكون هناك حاجة لتلطيخ الأغشية الحيوية ، واستنشاق كل السوائل المتبقية من المدخل وإعادة ملء نفس الخزان ب 100 ميكرولتر من مزيج تلطيخ الجدوى.
ثم ادفع محلول التلوين عبر القناة الدقيقة لمدة 45 دقيقة. تحت تدفق المشاركة المنخفض في درجة حرارة الغرفة ، تأكد من حماية الرقاقة من التعرض للضوء. قم بشفط كل السوائل المتبقية من خزان المدخل وأعد تعبئتها ب 100 ميكرولتر من PBS.
اغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة تحت تدفق منخفض للمشاركة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأصباغ الزائدة غير المرتبطة. أصبح الأغشية الحيوية الملونة جاهزة الآن للفحص المجهري الفلوري لفحص الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. يمكن استخدام عمليات إعادة البناء الرقمية باستخدام عمليات المسح الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر لعرض الهيكل الكلي للفيلم من أي زاوية مائلة.
علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق تحليل تلطيخ الميت الحي على نفس مجموعة بيانات البيانات لدراسة الاعتماد المكاني لبقاء الخلية داخل الأغشية الحيوية كدالة للمعالجات الكيميائية المختلفة. بمجرد تصوير الأغشية الحيوية ، يمكن استخراج الخلايا من القنوات غير الملطخة. باستخدام الماء المقطر الذي يعمل بتدفق قص عال ، يمكن بعد ذلك التعرف على فلورا الأغشية الحيوية من الحمض النووي الجيني عن طريق تسلسل 4 5 4 بايرو.
باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل إضافة أنواع أو مركبات مختلفة من أجل الإجابة على أسئلة مختلفة مثل ما يحدث للأغشية الحيوية متعددة الأنواع في ظل ظروف مختلفة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تصف ورقة الأساليب هذه نظامًا دقيقًا مصممًا لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحاكي اللويحات السنية فوق اللثة البشرية. يركز الدراسة على تقنيات تحليل بنية الأغشية الحيوية، وقابليتها للحياة، وجمعها لإجراء تحليلات إضافية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التدفق الدقيق
- أبحاث الأغشية الحيوية
- علم الأحياء الدقيقة السنية
الخلفية
- الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة من الكائنات الدقيقة.
- اللويحة السنية البشرية هي مثال شائع على الأغشية الحيوية.
- فهم تكوين الأغشية الحيوية أمر بالغ الأهمية لصحة الأسنان.
- الطرق الحالية لدراسة الأغشية الحيوية لها حدود.
غرض الدراسة
- لإنشاء أغشية حيويّة سنية متعددة الأنواع تمثيلية.
- لتطوير نظام عالي الإنتاجية لتحليل الأغشية الحيوية.
- لتحسين طرق دراسة قابلية حياة الأغشية الحيوية وبنيتها.
الطرق المستخدمة
- جمع عينات اللعاب من المتطوعين.
- إعداد وسط تمثيلي ولقاح.
- إدخال اللقاح إلى شريحة ميكروهيدروديناميكية.
- تلطيخ وتصوير الأغشية الحيوية باستخدام تقنيات الفحص المجهري.
النتائج الرئيسية
- تكوين ناجح للأغشية الحيوية داخل القنوات الدقيقة.
- قدرة عالية الإنتاجية تسمح بتجارب متعددة.
- تقليل استخدام المواد مقارنة بالطرق التقليدية.
- توفر التصوير في الموقع رؤى حول بنية الأغشية الحيوية.
الاستنتاجات
- يعد النظام الدقيق أداة فعالة لأبحاث الأغشية الحيوية.
- تعزز هذه الطريقة من فهم الأغشية الحيوية للوحي السنية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لتطبيقات متنوعة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic systems for multi-species oral biofilm development enable pharmaceutical R&D teams to model complex, disease-relevant microbial communities under physiologically relevant conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage anti-biofilm compound screening and informs target validation for oral health therapeutics. The system's scalability and use of natural human saliva enhance translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community dynamics and therapeutic hypothesis testing in a controlled, human-relevant environment.
- Supports biological de-risking by modeling in vivo-like biofilm complexity for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in identifying anti-biofilm targets and mechanisms relevant to oral disease.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multi-species biofilm systems for robust compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs through confocal imaging and viability assays.
- Enables high-throughput, parallel experimentation with reduced material requirements and increased assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant oral microbiota for translational biomarker studies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting genomic and architectural analyses.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical candidate selection for oral health interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic biofilm system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification and mechanistic de-risking for oral therapeutics.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by modeling native oral biofilm communities.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible biofilm systems with quantitative imaging and viability readouts.
- Analytics: Provides 3D architectural and viability data to compare compound effects across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease relevance through use of pooled human saliva and multi-species communities.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse oral biofilm research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation for anti-biofilm strategies.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in oral health portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oral biofilm-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, oral microbiology, and advanced imaging techniques.
- Needs access to confocal microscopy and genomic analysis infrastructure for comprehensive outputs.
- Demands rigorous cross-team standardization for saliva collection, biofilm growth, and data analysis.
- Adaptation across different microbial communities or disease models may require protocol optimization.
- Limitations include current throughput of imaging and the complexity of multi-species data interpretation.
