كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة بنية البروتين بدقة عالية باستخدام تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني المنبعث منه ووضع العلامات اللايتية ذات السلسلة الجانبية إلى جانب قياس الطيف الكتلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق التجميد أولا ، البروتين في وجود سواغات مختلفة. في تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني في الحالة الصلبة ، يتعرض البروتين المجفف بالتجميد لبخار أكسيد الديوتيريوم في مجفف مغلق تحت الرطوبة النسبية ودرجة الحرارة الخاضعة للرقابة.

بالنسبة لوضع العلامات اللايتية ، يتم تجميد البروتين بسواغات وعامل تفاعلي ضوئي. ثم يتم تشعيع القارورة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لربط العامل بالبروتين تساهميا. لكل طريقة ، يتم إعادة تشكيل العينات وتحليلها باستخدام مطياف الكتلة بدقة مستوى البروتين والببتيد السليمة.

توفر هاتان الطريقتان معلومات تكميلية. تظهر التركيبات التي يتم فيها الاحتفاظ ببنية البروتين بشكل كبير انخفاضا في امتصاص الديوتيريوم وزيادة الملصقات اللايتية ، في حين أن تلك ذات البنية المضطربة تظهر زيادة في امتصاص الديوتيريوم وانخفاض الملصقات اللايتية. تم مؤخرا تكييف الملصقات الكيميائية ، مثل تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني والربط المتقاطع للصور إلى جانب التحليل الطيفي الكتلي لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في الدعامات الحية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنيات على الطرق الحالية مثل التحليل الطيفي CD و FDIR هي أنه يمكن فحص بنية البروتين وبيئته بدقة عالية في الحالة الصلبة. للبدء ، ضع 200 مل من أكسيد الديوتيريوم في الحجرة السفلية من المجفف وأضف 400 جرام من كربونات البوتاسيوم لعمل محلول مشبع ، ضع صفيحة المجفف المصنوعة من البورسلين بالداخل وأغلق المجفف بإحكام. اسمح لها بالتوازن عند خمس درجات مئوية للوصول إلى رطوبة نسبية مستقرة قريبة من 43٪ بعد ذلك ضع القوارير غير المغطى التي تحتوي على بروتين مجفف بالتجميد في الجزء العلوي من المجفف ، وتغلق المجفف وتحتضن عند خمس درجات مئوية.

لبدء تفاعل تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني لجمع عينة ، قم بتغطية القارورة فور إزالتها من المجفف ثم قم بإخماد التفاعل عن طريق تجميد القارورة والنيتروجين السائل. قم بتخزين القارورة على حرارة سالب 80 درجة مئوية حتى التحليل الطيفي الكتلي. استخدم قياس الطيف الكتلي عالي الدقة لتحليل العينات لتقليل التبادل الخلفي.

كيف هو نظام الكروماتوغرافيا السائل داخل صندوق مبرد؟ لإعداد الأداة أولا ، قم بتوصيل حلقة العينة ومصيدة البروتين بالصمام الذي يتحكم في عمليات تحلية المياه والشطف. بعد ذلك ، قم بمعايرة النظام عن طريق حقن مزيج ضبط التركيز المنخفض في مطياف الكتلة وضبط نطاق نسبة الكتلة إلى الشحن من 200 إلى 3 ، 200.

ثم قم بتبريد النظام المبرد إلى درجة حرارة تشغيل ثابتة تبلغ حوالي صفر درجة مئوية. تحضير مخزن التبريد الذي يحتوي على 0.2٪ حمض الفورميك و 5٪ ميثانول في الماء وقم بتبريده على الثلج. بعد نقل العينات إلى النيتروجين السائل ، قم بإزالة القارورة بعناية وإعادة تكوين العينة عن طريق إضافة ملليلترين من محلول التبريد.

بعد ذلك ، قم بتحميل طريقة HPLC المناسبة وقياس الطيف الكتلي. لتحليل العينة هنا ، قم بتحلية 20 بيكومول من الميوغلوبين في مصيدة البروتين لمدة 1.7 دقيقة مع 5٪ أسيتيل نتريل و 0.1٪ حمض الفورميك. ثم قم بتصفية البروتين على مدى 3.3 دقيقة ، وزيادة إلى 80٪ أسيتو النتريل ، و 0.1٪ حمض الفورميك.

حقن العينة وجمع أطياف الكتلة على نطاق نسبة 200 إلى 3 ، 200 كتلة إلى شحن. لتحديد كتلة البروتين السليم كمرجع ، استخدم نفس الطريقة مع عينة بروتين مصنفة لا داعي لها. احصل على كتلة البروتين عن طريق فك الأطياف الخام باستخدام برنامج تحليل البيانات لتحليل عينة الميوغلوبين ، اضبط نطاق الكتلة من 15 إلى 18 ، كيلودالتون دقة الكتلة إلى دالتون واحد والطائرة الورقية الذروة إلى 90٪ لتحليل الببتيد ، قم بإعداد العينات باستخدام نفس البروتوكول الخاص بالبروتينات السليمة.

عندما تكون العينات جاهزة للتحليل ، قم بتوصيل عمود بيبين ثابت وعمود تحليلي بالصمام واستبدل مصيدة البروتين بمصيدة الببتيد. تم إجراء معايرة نظام الببتيدات للبروتينات السليمة ، ولكن عن طريق ضبط نطاق نسبة الكتلة إلى الشحن من 100 إلى 1700 ، ثم قم بتبريد النظام المبرد إلى درجة حرارة تشغيل ثابتة تبلغ حوالي صفر درجة. بمجرد معايرة النظام ، قم ببرمجة طريقة HPLC وقياس الطيف الكتلي المناسبة.

هنا هضم 20 بيكومول من الميوغلوبين على عمود بيبين مع 0.1٪ حمض الفورميك في برنامج الماء طريقة حبس وتحلية الببتيدات في مصيدة الببتيد لمدة 1.7 دقيقة مع 10٪ أسيتيل نتريل و 0.1٪ حمض الفورميك ، والتخلص من الببتيدات في أربع دقائق مع زيادة التدرج إلى 60٪ أسيتيل النتريل و 0.1٪ حمض الفورميك. بعد ذلك ، قم بحقن العينة وجمع أطياف الكتلة على نطاق نسبة الكتلة إلى الشحن من 100 إلى 1700. تحليل عينة الببتيد غير المؤرخة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي لتحديد الشظايا الهضمية.

ثم تحقق من الجزء المحدد تجريبيا باستخدام الكتل المتوقعة التي تم إنشاؤها بواسطة البرامج. بعد ذلك ، اضبط قطع الكتلة على 10 أجزاء في المليون للتخلص من الكتل ذات الخطأ الكبير للببتيدات ذات المباريات. لاحظ حالة شحن تسلسل الببتيد ووقت الاستبقاء.

استخدم بيانات الببتيد المجمعة لحساب متوسط عدد الديوتيروس المدمجة لكل جزء هضمي باستخدام برنامج تحليل البيانات أولا ، قم بتجميد البروتين باستخدام السواغ واللوسين كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تحضير العينات ، قم بتشغيل الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية التي تحتوي على مصابيح UV 365 نانومتر. اترك المصابيح تدفئ لمدة خمس دقائق.

بمجرد تسخين المصابيح ، أطفئها وضع القوارير غير المغطى التي تحتوي على التركيبة داخل غرفة الربط المتشابك. قم بتشعيع العينات بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 دقيقة وقم بتضمين عينات بدون فوتو-ليوسين كعنصر تحكم بعد تشعيع الغطاء وتخزين القوارير عند سالب 20 درجة مئوية حتى التحليل الطيفي الكتلي. قم بإعداد العينات للتحليل عن طريق إضافة الماء المقطر بدرجة قياس الطيف الكتلي للحصول على تركيز بروتين نهائي يبلغ اثنين من الضرس الصغير.

بعد ذلك ، قم بتحليل العينات باستخدام نفس طريقة قياس الطيف الكتلي للبروتينات السليمة. لكن لا تستخدم نظام LC المبرد. احصل على بيانات قياس الطيف الكتلي لعينة بروتين غير مصنفة لتحديد الكتلة الأصلية للبروتين.

قم بإجراء تحليل البيانات كما هو الحال بالنسبة للعينات DERATED لتحليل مستوى الببتيد. أولا ، قم بإجراء وضع العلامات على اللحيرات الضوئية ذات الحالة الصلبة باستخدام البروتينات السليمة وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، أعد تكوين العينة باستخدام 100 مللي مولار من بيكربونات الأمونيوم للحصول على تركيز بروتين نهائي يبلغ 10 ميكرومولار.

امزج العينة مع التربسين بنسبة 10 إلى مولية واحدة من البروتين إلى التربسين واحتضان هذا الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. في غضون ذلك ، قم بتوصيل حلقة العينة ومصيدة الببتيد والعمود التحليلي بصمام نظام HPLC. بعد هضم البروتين ، قم بإخماد التفاعل بإضافة 0.1٪ حمض الفورميك في الماء للحصول على تركيز بروتين نهائي يبلغ اثنين من الضرس الصغير.

بعد ذلك ، قم ببرمجة النظام باستخدام HPLC وطرق قياس الطيف الكتلي. هنا حقن وتحلية 20 بيكومول من الميوغلوبين المهضوم في مصيدة الببتيد لمدة 1.5 دقيقة مع 5٪ أسيتو نتريل و 0.1٪ حمض الفورميك يتخلص من الببتيدات عن طريق زيادة التدرج على مدى 22 دقيقة إلى 55٪ أسيتيل نتريل وجمع أطياف الكتلة على مدى من 100 إلى 1700 كتلة إلى نسبة الشحن. استخدم أداة عبر الإنترنت لحساب الكتلة النظرية للببتيد.

مقرب الصورة ليوسين مع أرقام الليوسين الضوئي التي تم الحصول عليها مسبقا من تحليل البروتين السليم. قم بتضمين أربعة انقسامات مفقودة على الأقل. قم بإنشاء قائمة كبيرة في Excel لمقرب صورة الببتيد ليوسين.

بعد ذلك ، قم بمطابقة قائمة الكتلة النظرية مع الكتل التي تمت ملاحظتها تجريبيا عن طريق تعيين نقطة قطع لتحديد الكتل ذات الخطأ المنخفض. أثناء تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني ، يسمح الكشف عن البروتين باستبدال الهيدروجين ببروتينات الديوتيريوم التي تحتفظ بهيكلها وتكون أقل عرضة لتبادل الديوتيريوم. عندما تم إجراء قياس الطيف الكتلي لتبادل الديوتيريوم للهيدروجين في الحالة الصلبة على تركيبات المحتوية على التالوز والسوربيتول المحتوية على الميوغلوبين ، أظهرت التركيبة المحتوية على السوربيتول امتصاصا أكبر للديوتيريوم بنسبة 46٪ ، مما يشير إلى أن بنية الميوغلوبين في السوربيتول تكون أكثر اضطرابا أثناء عملية الحالة اللايتية.

الصور ، الليوسين ، الروابط المتقاطعة ، إلى السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها. أظهر تحليل قياس الطيف الكتلي الليتي الضوئي للحالة الصلبة للسوربيتول و TLOs المحتوية على تركيبات الميوغلوبين امتصاصا للصور في تركيبة TLOs أكثر من نظيرتها. يشير هذا إلى أن السلاسل الجانبية ظلت متاحة في صياغة TLOs.

يستخدم كل من تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني ووضع العلامات اللايتية المناطق المتاحة تجاريا وأجهزة MS المتاحة بسهولة لتوصيف البروتينات في الحالة الصلبة لأي تركيبة معينة. السجل الزمني الإجمالي من إعداد العينة إلى تحليل البيانات الكامل أقل من أسبوعين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على معلومات عالية الدقة حول بنية البروتين وأهميته في تصميم تركيبات البروتين المجففة بالتجميد المستقرة.