تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التجميع الديناميكي لمجمعات البروتين في بيئات الأس الهيدروجيني المختلفة باستخدام قياس تداخل الطبقة الحيوية وتأكيد المكونات باستخدام المجهر الإلكتروني وقياس الطيف الكتلي. يعد تحديد وفهم الخصوصية التي تحكم تكوين مركب البروتين وتجميعه أمرا ذا أهمية كبيرة للباحثين في الكيمياء الحيوية. تسمح المنهجية التي نتحدث عنها اليوم للباحثين بتجميع المجمعات الجزيئية الكبيرة المتوقعة وتصورها والتحقق من صحتها.

الطبيعة المعقدة لسطح المستشعر الحيوي للباحثين بإطلاق المجمعات المجمعة بسهولة في أحجام صغيرة للفحص المجهري الإلكتروني وتحليل الطيف الكتلي. في هذا العرض التوضيحي ، تابعنا حركية عمليات إعادة الترتيب الهيكلي الناجم عن الأس الهيدروجيني لمركب توكسين الجمرة الخبيثة وتحققنا من عمليات إعادة الترتيب هذه عن طريق المجهر الإلكتروني وطرق قياس الطيف الكتلي ، كل ذلك مع تجنب التجميع. سيتم توضيح تجميع سموم الجمرة الخبيثة على سطح المستشعر الحيوي BLI ، وإطلاق العينة الكلية وإجراءات التلوين السلبي EM ، ألكسندرا ماشين وبيرس أونيل ، طلاب الدراسات العليا من مختبري.

يلعب الدكتور أنطونيو أرتيج دورا أساسيا في تحليل وتحديد العينات الدقيقة التي تم إصدارها من قبل BLI ، باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Fusion Lumos. للبدء ، قم بترطيب طرف مستشعر حيوي BLI التفاعلي من الجيل الثاني عن طريق غمره في 250 ميكرولتر من الماء واحتضانه لمدة 10 دقائق. في برنامج Blitz ، قم ببرمجة أوقات الخطوات كما هو موضح في هذا الجدول.

ابدأ تشغيل BLI عن طريق غمر طرف المستشعر الحيوي في 250 ميكرولتر من الماء لمدة 30 ثانية لقياس خط الأساس الأولي لسمك المستشعر الحيوي وكثافته. بعد ذلك ، قم بتنشيط المستشعر الحيوي عن طريق غمر الطرف في 250 مل من 50 ملليمولار NHS و 200 مللي مولار EDC لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، اغمر المستشعر الحيوي المنشط في 50 مللي مولار PDEA المذاب في محلول بورات 0.1 مولار ، درجة الحموضة 8.5 ، لمدة خمس دقائق لتوليد سطح منشط بيولوجيا.

الآن ، اغمر المستشعر الحيوي التفاعلي الحيوي المنشط في 250 ميكرولتر من محلول يحتوي على 100 نانومولار E126C LFn في 10 ملليمولار من أسيتات الصوديوم الأس الهيدروجيني خمسة ، 100 ملليمولار محلول كلوريد الصوديوم لمدة خمس دقائق. اغمر طرف LFn في 50 مللي مولار L-cysteine ، 1 مولي كلوريد الصوديوم ، 0.1 مولار أسيتات الصوديوم درجة الحموضة خمسة لمدة أربع دقائق لإرواء أي مجموعات متبقية من تفاعل الثيول الحر. بعد غمر طرف LFn المروي في 50 ملليمولار تريس ، 50 مللي مولي كلوريد الصوديوم لإنشاء خط أساس عازل ، اغمر الطرف في 0.5 مستعد مستضد واقي ميكرومولار ، 50 ملليمولار تريس ، 50 ملليمولار كلوريد الصوديوم لمدة خمس دقائق لإنشاء مركب LFn PA-prepore.

بمجرد ربط PA-prepore ، قم بإزالة الطرف من محلول PA-prepore واغمر الطرف في 50 مللي مولار Tris ، 50 مللي مولار كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية لغسل أي PA-prepore غير مرتبط على وجه التحديد. اغمر مركب LFn PA-prepore في 0.5 ميكرومولار CMG2 في 50 مللي مولار تريس ، 50 مللي مولار كلوريد الصوديوم لمدة خمس دقائق. اغمر مركب LFn PA-prepore CMG2 في 50 مللي مولار تريس ، 50 مللي مولار كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية لغسل أي CMG2 غير مرتبط لتشكيل مركب ما قبل الإندوسوم.

لتحليل EM ، حرر مركب LFn PA-prepore CMG2 من طرف المستشعر الحيوي عن طريق غمر الطرف في أنبوب PCR يحتوي على خمسة ميكرولترات من 50 ملليمولار DTT و 50 ملليمولار Tris و 50 مللي مولار كلوريد الصوديوم. لتحليل MS الترادفي للببتيدات من المركب ، حرر مركب LFn PA-prepore CMG2 من طرف المستشعر الحيوي عن طريق غمر المستشعر الحيوي في أنبوب PCR يحتوي على خمسة ميكرولترات من 50 مللي مولار DTT ، وستة مولاري خالية من الكيراتين ، وبيكربونات الأمونيوم 25 ملليمولار ، درجة الحموضة ثمانية. لعرض المركب بعد انتقال الأس الهيدروجيني ، قم بتجميع مركب LFn PA-prepore CMG2 على المستشعر الحيوي ، كما هو موضح للتو.

اغمر طرف المستشعر الحيوي في 10 مللي مولار الأسيتات درجة الحموضة خمسة لمدة خمس دقائق لبدء انتقال PA-prepore إلى PA-pore. يشار إلى هذا الانتقال من خلال زيادة السعة ، متبوعا بانخفاض أكبر في السعة يفترض أنه كبير للتفكك الكامل للمستقبلات بسبب تناقص تقارب الارتباط. لتحليل EM ، اغمر طرف المستشعر الحيوي في محلول يحتوي على 1.25 مللي مولار مذيلات لمدة خمس دقائق ، لمنع التراكم في المحلول بعد إطلاق ثاني كبريتيد.

لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني للبقع السالبة ، ابدأ بتوهج تفريغ شبكة نحاسية مطلية بالكربون 300 عند ضغط جوي مستقر 0.38 مللي بار وناقص 15 مللي أمبير لمدة 20 ثانية ، ثم تنفيس الجهاز بالهواء. قم بتأمين الشبكة بين زوج من الملقط النظيف. ثم قم بإخراج أربعة ميكرولترات من العينة المعقدة التي تم إطلاقها على الشبكة والسماح بالامتصاص لمدة 60 ثانية.

باستخدام إسفين من ورق الترشيح ، قم بإزالة السائل المتبقي. ثم قم بتلطيخ الشبكة عن طريق سحب خمسة ميكرولترات من 0.75٪ نقطة صفر ميكرون فورمات اليورانيل المفلترة عليها وبعد خمس ثوان ، قم بإزالة البقعة الزائدة. اترك الشبكة تجف في درجة حرارة الغرفة أثناء تغطيتها.

ثم استخدم المجهر الإلكتروني للإرسال لعرض العينة. أخيرا ، بعد تحضير عينات لقياس الطيف الكتلي وفقا لبروتوكول النص ، قم بتشغيل مطياف الكتلة باستخدام CID وطاقة تصادم طبيعية تبلغ 35 تحت التحكم الآلي لإجراء فحص MS واحد باستمرار ، متبوعا بأكبر عدد ممكن من عمليات مسح MS-MS الترادفية في فترة ثلاث ثوان. تتبع الرسم المنطقي BLI هو قراءة في الوقت الفعلي لتغيرات السعة بسبب الإضافة المحددة لمكونات توكسين الجمرة الخبيثة.

الارتفاع الأول هو تحميل LFn على الحافة. بعد التبريد وخط الأساس ، يرتبط PA-prepore ب LFn ، متبوعا بإضافة CMG2 قابل للذوبان ، مما ينتج عنه مركب ما قبل الإندوسوم المجمع. ثم يخضع المركب لدرجة حموضة منخفضة تضعف ارتباط المستقبلات وتؤدي إلى انتقال المسام الأولية إلى تأكيد المسام الممتدة التي يتم تأكيدها بإضافة المذيلات.

تظهر هنا صور EM للبقع السلبية للمجمعات عند إطلاقها من المستشعر الحيوي. أظهرت شبكات العينات قبل الداخلية كثافات متسقة مع المجمعات الثلاثية السليمة التي تتكون من LFn PA-prepore CMG2. تظهر الشبكات المعقدة بعد التحمض أن PA ينتقل إلى المسام ويذوب عن طريق إدراج المذيلات بدون كثافة CMG2 واضحة.

كما رأيت التصلب العصبي المتعدد ، التي أكدت مجمعات البروتين ، احتوت عينات التصلب العصبي المتعدد قبل الإندوسوم على ببتيدات من جميع مكونات السم الثلاثة بتغطية 60.46 و 67.97 و 54.15٪ ل LFn و PA و CMG2 على التوالي. احتوت عينات ما بعد الإندوسوم فقط على ببتيدات من LFn و PA. يتوافق نقص CMG2 مع انخفاض نانومتر BLI الملحوظ أثناء تكوين المسام. تعد القدرة على مراقبة تجميع مجمعات الجزيئات الكبيرة والتحقق من صحتها خطوة حاسمة نحو فهم خصوصية ووظائف التجميعات الجزيئية الحيوية الكبيرة.

ستكون قدرتنا على إطلاق المجمعات الجزيئية المجمعة مسبقا من أجهزة الاستشعار الحيوية إلى الأحجام الدقيقة لتصور المجهر الإلكتروني مفيدة للغاية لتحليل الهيكل. استخدم تحليلنا لتكوين مجمعات تجميع المستشعرات الحيوية فقط 0.04 فيمتومول من مركب الإطلاق لتحديد مكوناته قبل وبعد التحمض الداخلي الممتص. يمكن تكييف بروتوكول إطلاق تجميع المستشعر الحيوي لمتابعة التحولات الداخلية الطبيعية ولكن المراوغة التي يسببها الأس الهيدروجيني للسموم البكتيرية الأخرى في هياكل البروتين الفيروسي ، مع ميزة إضافية تتمثل في تجنب تراكم البروتين.