تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

الهدف العام للتجربة التالية هو التقييم الكمي للتوطين المكاني للأزواج المستهدفة ، في هذه الحالة ، فحص الاتجار بالمستقبلات التي يسببها المخدرات. ويتحقق ذلك عن طريق معالجة الخلايا المستنبتة الحية بالمخدرات للحث على تغيير الاتجار بالمستقبلات. كخطوة ثانية ، يسمح وضع العلامات المناعية المزدوجة للمستقبلات المستهدفة ومقصورات الاتجار داخل الخلايا بالتوطين المكاني للأزواج المستهدفة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر متعدد القنوات.

يستخدم تحليل التحديد الكمي لقياس ميل المستقبلات والأجزاء المستهدفة ليتم العثور عليها في نفس المكان. تظهر النتائج تغيرات في تهريب المستقبلات بعد العلاج بالمخدرات بناء على تحديد موقع المستقبلات ومقصورات الاتجار داخل الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل التراكب ، هي أنها توفر مقاييس كمية للتوطينية ، والتي تسمح بعد ذلك بتحليلات أكثر قوة وتصميمات تجريبية معقدة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتهريب المستقبلات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التغييرات في التحديد المكاني لأي بروتينين تقريبا في الخلايا المستنبتة. لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة وسط النمو الأصلي واستبدله بوسط يحتوي على الدواء المعني بالتركيز المختار. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في ظروف النمو الأصلية لمدة العلاج المختارة.

بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق باستخدام مليلتر واحد من محلول الغسيل في كل مرة لمدة ثلاث مرات. قم بإصلاح الخلايا ب 300 ميكرولتر من 4٪ بارا فورمالديهايد في 0.1 مولار PBS لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام مليلتر واحد من مخزن الغسيل في كل مرة لمدة ثلاث مرات.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا ذات الأجسام المضادة الأولية في 300 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام مليلتر واحد من مخزن الغسيل في كل مرة لمدة ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي مترافق مع فلور في 300 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة من درجة حرارة الغرفة وحماية الخلايا من الضوء. بعد ساعة واحدة ، اغسل الخلايا برفق باستخدام ملليلتر واحد من محلول الغسيل في كل مرة لمدة ثلاث مرات. لإزالة زلة الغطاء من لوحة 24 بئر ، امسك اللوحة بزاوية 45 درجة.

ضع طرف زوج من الملقط الناعم على الحافة العلوية لزلة الغطاء حيث يلتقي بأرضية البئر. ثم قم بإمالة زلة الغطاء برفق في عازلة الغسيل بعيدا عن أرضية البئر. سوف يستقر انزلاق الغطاء على جدار البئر حيث يمكن إزالته بسهولة باستخدام الملقط.

ثم قم بتركيب زلات الغطاء بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل على شرائح المجهر مع وسيط تركيب مضاد للبهتان باستخدام هدف تكبير عالي 100 ×. أولا ، حدد موقع خلية تمثيلية ليتم تصويرها باستخدام مضان epi. بعد ذلك، قم بتكوين إعدادات التقاط الصور سجل ثمانية صور tiff غير مضغوطة لكل قناة مسماة لتصوير كل قناة بالتتابع ومتوسط أربع إلى ست عمليات مسح للصورة النهائية.

ثم قم بالتبديل إلى مسار التصوير متحد البؤر وركز على مستوى Z عبر مركز الخلية. قم بتحسين طاقة الليزر ذات الثقب وجهد أنبوب مضاعف الصور وإزاحة كل قناة. سجل هذه الإعدادات واستخدم نفس الإعدادات لتصوير جميع الخلايا المسماة لأي زوج هدف معين.

في نفس النسخ المتماثل لخلايا محدد المواقع التالية المراد تصويرها بهدف تكبير عالي. باستخدام مضان epi ، قم بالتبديل إلى مسار التصوير متحد البؤر وركز على مستوى Z عبر مركز الخلية إذا كان متاحا. استخدم وظيفة اقتصاص التكبير/التصغير للبرنامج لتقييد منطقة المسح الضوئي بالخلية ذات الاهتمام. بعد ذلك.

التقط الصور لكل قناة مسماة باستخدام الإعدادات التي تم إنشاؤها مسبقا، وكرر الإجراءات لتصوير 15 خلية أو أكثر لكل شرط لكل نسخ متماثل. لضمان جمع عينات كافية. في هذا الإجراء، افتح زوج صور خلية في الصورة J.استخدم الأمر image color merge channels لإنشاء صورة RGB.

ثم ارسم حول الخلية محل الاهتمام. استخدم المكون الإضافي للصورة j في SC colocalization لتحديد التحديد المشترك للأهداف في الخلية المحددة. سجل مقياس تحديد الموقع المشترك المطلوب وكرر الإجراء لكل خلية صورة.

بعد ذلك ، احسب متوسط قيم التحديد المشترك المسجلة لشروط التحكم المشتركة لكل نسخة مكررة لكل حالة تسمية. اضرب الوسائل في ناقص واحد لإنتاج الإزاحة لكل تكرار في كل حالة تسمية. ثم أضف الإزاحة لكل نسخة متماثلة في كل شرط تسمية إلى كل قيمة مشاركة في هذا النسخ المتماثل.

سيؤدي هذا إلى تطبيع البيانات بحيث يكون متوسط مقياس التحديد المشترك لشرط التحكم المشترك صفرا في كل نسخة مكررة من كل شرط تسمية. بعد ذلك ، ستسمح جميع البيانات من جميع التكرارات لكل حالة وضع العلامات بتحليل التغييرات في التموضع المشترك عبر التكرارات الموضحة هنا هي الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحسية للعقد الجذرية الظهرية التي تعرضت لعلاجات دوائية طويلة وحادة. ثم تم تصنيف الخلايا مناعية لمستقبلات دلتا الأفيونية وعلامة إعادة تدوير الجسيمات الداخلية مع أزواج الأجسام المضادة الثانوية الأولية المميزة وتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر المتسلسل.

بالإضافة إلى التحديد والتحليل الكمي اللاحق ، تمت معالجة هذه الصور التمثيلية لإنشاء خرائط تحديد موقع الألوان الزائفة الموضحة هنا. تمت مقارنة متوسط درجات التموضع المشترك لمستقبلات دلتا الأفيونية وعلامات الإندوسومات الداخلية المبكرة وإعادة تدوير الجسيمات الداخلية ومستقبلات الجسيمات الحالة مع كل حجرة بين المجموعات التي تتلقى علاجات دوائية حادة مختلفة ولوحظت التغيرات الناجمة عن المخدرات في الاتجار بالمستقبلات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحصول على صور مجهرية متسقة عالية الجودة للسماح بتحليل كمي صالح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل التحديد الكمي.