تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

الهدف العام من التجربة التالية هو التقييم الكمي للتوضع المشترك المكاني لأزواج مستهدفة، وفي هذه الحالة، فحص حركة المستقبلات الناجمة عن تأثير الدواء. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة خلايا مستزرعة حية بالدواء لتحفيز تغيير في حركة المستقبلات. وكخطوة ثانية، يتيح الوسم المناعي المزدوج للمستقبلات المستهدفة ومقصورات النقل داخل الخلايا التحديد المكاني للأزواج المستهدفة باستخدام المجهر البؤري متعدد القنوات لاحقاً.

يُستخدم تحليل التوطن المشترك الكمي لقياس مدى ميل المستقبلات المستهدفة والمقصورات الخلوية للتواجد في المكان ذاته. وتُظهر النتائج التغيرات في حركة المستقبلات بعد العلاج الدوائي بناءً على التوطن المشترك للمستقبلات ومقصورات النقل داخل الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التوطن المشترك بالتراكب، في أنها توفر مقاييس كمية للتوطن المشترك، مما يتيح إجراء تحليلات أكثر قوة وتصاميم تجريبية أكثر تعقيداً.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول انتقال المستقبلات، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على التغيرات في التوضع المشترك المكاني لأي بروتينين تقريبًا في الخلايا المستزرعة. لبدء هذا الإجراء، قم بإزالة وسط النمو الأصلي واستبداله بوسط يحتوي على العقار المطلوب بالتركيز المختار. بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا في ظروف النمو الأصلية لمدة المعالجة المختارة.

بعد الحضن، اغسل الخلايا بلطف باستخدام 1 mL من محلول الغسيل في كل مرة، وذلك لثلاث مرات. قم بتثبيت الخلايا باستخدام 300 µL من البارافورمالدهيد بتركيز 4% في PBS بتركيز 0.1 M لمدة 10 دقائق عند 37 °C. ثم اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام 1 mL من محلول الغسيل في كل مرة، وذلك لثلاث مرات.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في 300 µL من محلول الحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. عقب ذلك، تُحضن الخلايا مع الجسم المضاد الأولي في 300 µL من مخفف الجسم المضاد لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة 4 °C. ثم تُغسل الخلايا بلطف باستخدام 1 mL من محلول الغسيل في كل مرة، وذلك لثلاث مرات.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا مع جسيم مضاد ثانوي مقترن بفلوروسنت في 300 µL من مخفف الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع حماية الخلايا من الضوء. وبعد مرور ساعة واحدة، تُغسل الخلايا برفق باستخدام 1 mL من محلول الغسل في كل مرة، وذلك لثلاث مرات. ولإزالة الشريحة الغطائية من طبق الـ 24 بئراً، يُمسك الطبق بزاوية 45 درجة.

ضع طرف ملقط دقيق عند الحافة العلوية لغطاء الشريحة حيث يلتقي بقاع البئر. ثم قم بإمالة غطاء الشريحة بلطف في محلول الغسيل بعيداً عن قاع البئر. سيستقر غطاء الشريحة مقابل جدار البئر، حيث يمكن إزالته بسهولة باستخدام الملقط.

بعد ذلك، قم بتثبيت شرائح التغطية بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل على شرائح مجهرية باستخدام وسط تثبيت مضاد للتلاشي، وذلك باستعمال عدسة شيئية ذات تكبير عالٍ 100x. أولاً، حدد خلية ممثلة ليتم تصويرها باستخدام الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence). بعد ذلك، قم بتكوين إعدادات التقاط الصور، وسجل صور tiff غير مضغوطة بدقة 8-بت لكل قناة مُعلمة لتصوير كل قناة بالتتابع، ومعالجة متوسط أربعة إلى ستة مسوحات للصورة النهائية.

ثم انتقل إلى مسار التصوير البؤري (confocal) وقم بالتركيز على المستوى Z المار بمركز الخلية. قم بتحسين قدرة ليزر الثقب (pinhole) وجهد وإزاحة أنبوب المضاعف الضوئي لكل قناة. سجل هذه الإعدادات واستخدم الإعدادات نفسها لتصوير جميع الخلايا المصبوغة لأي زوج مستهدف معين.

في نفس المكررة، حدد الخلايا الموضعية التي سيتم تصويرها باستخدام عدسة شيئية ذات تكبير عالٍ. وباستخدام الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence)، انتقل إلى مسار التصوير البؤري (confocal) وقم بضبط التركيز على مستوى Z يمر عبر مركز الخلية إذا كان ذلك متاحاً. استخدم وظيفة قص الزووم البرمجية لحصر منطقة المسح في الخلية المستهدفة. بعد ذلك.

التقط صوراً لكل قناة مُعلمة باستخدام الإعدادات المحددة مسبقاً، وكرر الإجراءات لتصوير 15 خلية أو أكثر لكل حالة في كل مكررة، وذلك لضمان جمع عينات كافية. في هذا الإجراء، افتح زوج الصور الخاص بالخلية في برنامج Image J، واستخدم أمر دمج قنوات ألوان الصور (image color merge channels) لإنشاء صورة RGB.

بعد ذلك، ارسم تحديداً حول الخلية المستهدفة. استخدم إضافة SC colocalization في برنامج ImageJ لقياس درجة التوضع المشترك للأهداف في الخلية المختارة. سجّل مقياس التوضع المشترك المطلوب وكرر الإجراء لكل خلية في كل صورة.

بعد ذلك، احسب متوسط قيم التوضع المشترك المسجلة لظروف التحكم الشائعة لكل مكرر من كل حالة وسم. اضرب المتوسطات في سالب واحد للحصول على قيمة الإزاحة لكل مكرر في كل حالة وسم. ثم أضف قيمة الإزاحة الخاصة بكل مكرر في كل حالة وسم إلى كل قيمة توضع مشترك في ذلك المكرر.

سيؤدي ذلك إلى تطبيع البيانات بحيث يكون متوسط قياس التوضع المشترك لشرط الضبط الشائع صفراً في كل مكرر لكل حالة وسم. بعد ذلك، ستسمح جميع البيانات من جميع مكررات كل حالة وسم بتحليل التغيرات في التوضع المشترك عبر المكررات. تظهر هنا المزارع الأولية للعصبونات الحسية في العقد الجذرية الظهرية التي تعرضت لمعالجات دوائية طويلة الأمد وحادة. بعد ذلك، تم وسم الخلايا مناعياً لمستقبلات دلتا الأفيونية وعلامة الجسيمات الحالة لإعادة التدوير باستخدام أزواج متميزة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وتم تصويرها بواسطة المجهر البؤري المتسلسل ثنائي القناة.

بالإضافة إلى التحليل والتموضع المشترك الكمي اللاحق، تمت معالجة هذه الصور التمثيلية لإنشاء خرائط التموضع المشترك بالألوان الاصطناعية الموضحة هنا. تمت مقارنة متوسط درجات التموضع المشترك لمستقبلات دلتا الأفيونية وعلامات الإندوسومات المبكرة والإندوسومات المعاد تدويرها والليزوزومات من حيث التموضع المشترك للمستقبل مع كل مقصورة بين المجموعات التي تلقت علاجات دوائية حادة مختلفة، ولوحظت التغيرات التي أحدثتها الأدوية في نقل المستقبلات. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحصول على صور مجهرية متسقة وعالية الجودة للسماح بإجراء تحليل كمي صالح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل التوضع المشترك الكمي.