متزامنة فيفو السابقين اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل في الجسم الحي نظام مخطط كهربية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم وظيفة الخلايا من شبكية الفأر المعزولة باستخدام نظام تجاري في الجسم الحي أو مخطط كهربية الشبكية أو ERG مع محول ex vivo. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح شبكية العين أولا من كلتا عيني الفأر. الخطوة الثانية هي تركيب جانب المستقبلات الضوئية لشبكية العين لأعلى في حامل العينة.

بعد ذلك ، يتم وضع حامل العينة على لوحة تسخين في نظام ERG في الجسم الحي ويتم توصيله بالتروية التي يتم التحكم فيها بالجاذبية. تتمثل الخطوة الأخيرة في توصيل أقطاب حامل العينة بمكبر للصوت وتحفيز شبكية العين بالضوء للحصول على استجابات ERG. في النهاية ، يتم استخدام ERG خارج الجسم الحي لإظهار كيفية تشريح مسارات الإشارات بوساطة القضيب والمخروط باستخدام علم الأدوية وبروتوكولات تحفيز الضوء المتخصصة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل التسجيلات في الجسم الحي أو ERGs أو التسجيلات أحادية الخلية ، هي أنها توفر نسبة إشارة أعلى إلى الضوضاء تسجيلات أطول وأكثر استقرارا ، بالإضافة إلى إمكانية التلاعب الدوائي السهل والكمي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص فعالية وسلامة الأدوية المصممة لعلاج أمراض الشبكية في شبكية العين من الرئيسيات والمتبرعين من البشر قبل يوم واحد على الأقل ، قم بتعديل الجزء السفلي من حامل العينة عن طريق لصق بعض ورق الترشيح الرمادي الأسود في الجزء العلوي من القباب. استخدم مكونين من الايبوكسي لمدة خمس دقائق على طول حواف القباب ، وإذا لزم الأمر ، استخدم مجهر تشريح بعد أن يجف الغراء ، اضغط على ورق الترشيح بشكل مسطح إلى القبة.

سيكون جيدا لمدة شهر تقريبا من التسجيل. ثم قم بإزالة الورق وتنظيف القبة بنسبة 70٪ من الإيثانول. الآن لتحضير القطب أولا ، املأ قنوات القطب بمحلول القطب.

حاول تجنب إدخال فقاعات الهواء. ثم قم بربط أقطاب الحبيبات في قنوات القطب. قم بتوصيل القطع العلوية والسفلية من حامل العينة بأربعة براغي واملأ خطوط التروية بمحلول القطب.

بعد ذلك ، قم بقياس المقاومة والجهد بين خيوط أزواج الأقطاب الكهربائية. يجب أن تكون المقاومة أقل من 100 كيلو أوم والجهد أقل من 10 مللي فولت. إذا كانت القنوات خالية من الفقاعات وكانت الأقطاب الكهربائية في حالة جيدة ، فقم الآن بصب 400 إلى 700 مل من وسائط التروية في زجاجة زجاجية لتروية العينة.

أيضا ، اسكب 300 مل للتشريح وقم بتخزينه في الثلاجة. ثم ضع أنبوب التروية من خلال كتلة المبادل الحراري وضع الكتلة المسخنة مسبقا على لوحة التسخين. الآن قم بإحاطة الزجاجة بغطاء يحتوي على مدخل غاز ومدخل أنابيب نضح.

يجب توصيل مدخل الغاز بحجر هواء. ضع الزجاجة المسخنة مسبقا حيث سيتم الحفاظ على وسائط التروية عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتجهيز خطوط التروية عن طريق ملئها بوسائط التروية لبدء التدفق المدفوع بالجاذبية في نظام علمي ocus.

ضع الزجاجة داخل قفص فاراداي لتقليل الضوضاء واستخدم خطوط إخراج التروية الطويلة من حامل العينة. يتم وضع أقل بكثير من مستوى حامل العينة وزجاجة التروية ، وحماية خطوط الإخراج هذه وتوصيل الدرع بأرضية مكبر الصوت من خلال قفص فاراداي. لمنع اقتران الضوضاء الكهرومغناطيسية بإشارة ERG ، قم بتوصيل مسبار درجة الحرارة بمرحلة التسخين.

الآن باستخدام المنظمين ، اضبط تدفق المحلول على ثلاثة إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة. أخيرا ، إذا لزم الأمر ، أدخل السيارة والغاز في المحلول واضبط المنظم لتيار مستمر من الفقاعات من حجر الهواء. ابدأ بسكب حوالي 200 مل من محلول التروية الباردة في طبق بتري كبير بحيث يمكن غمر الجزء السفلي بالكامل من حامل

القتل الرحيم لحيوان نشأ تحت دورة ضوء داكن مدتها 12 أو 12 ساعة ثم تكيف الظلام لمدة ست إلى 12 ساعة قبل التسجيلات. يجب تنفيذ جميع الإجراءات التالية تحت ضوء أحمر خافت أو ضوء الأشعة تحت الحمراء. بعد عزل كل عين ، ضعيها في وسط العين.

ثم انقل عين واحدة إلى قطعة صغيرة من ورق الترشيح على الورق. أمسكها بالملاقط واقطع شقا فيها على نفس مستوى الهالة من الشق. قم بقص على طول الهالة أو في مكان أقرب إلى خط الاستواء لإزالة القرنية والعدسة.

ثم قم بإزالة القرنية ونهايات العدسة وانقل كوب العين مرة أخرى إلى الوسط البارد. كرر نفس الإجراء مع العين الأخرى. تعمل الآن مع كوب العين ، وقم بعمل شق صغير من الأعلى باتجاه العصب البصري.

احتفظ بالمقص بين الشبكية والصلبة حتى تظل شبكية العين سليمة قدر الإمكان. بعد ذلك ، أمسك الصلبة على جانبي الشق باستخدام ملاقط وافصل الأنسجة لفصل شبكية العين. لعزل شبكية العين ، قم بقطع العصب البصري وإزالة شبكية العين بأقل قدر من التلامس مع سطحها البعيد.

الآن ، قم بتركيب شبكية العين المعزولة على قباب حامل العينة. أولا ، اغمر الجزء السفلي من حامل العينة في طبق بتري مع شبكية العين التي تم تشريحها. الشريحة التالية.

المستقبلات الضوئية لشبكية العين أو الجانب المحدب لأعلى فوق القبة. ثم ارفع حامل العينة برفق حتى تلتصق شبكية العين بورق الترشيح. ثم كرر الإجراء لشبكية العين الأخرى.

الآن جفف لوحة الحامل بعناية لمنع ضوضاء الحديث المتبادل وتحويل الإشارة. بعد تجفيف الحامل ، قم بربط الجزء العلوي واملأ قنوات التروية بمحلول التروية من حقنة باستخدام إبرة. ضع حامل العينة بجوار كتلة التبادل الحراري.

ثم قم بتوصيل خطوط التروية المدخلة والإخراج. أكمل الإعداد عن طريق توصيل الأقطاب الكهربائية بمكبر الصوت ERG وتوصيل وحدة التحكم في المحفز بحامل العينة. استخدام محول للحصول على استجابات كبيرة وقابلة لإعادة الاستخدام ، من المهم إجراء تشريح دقيق وتركيب شبكية العين ، بالإضافة إلى الحفاظ على نضح مستقر وخالي من الفقاعات فوق شبكية العين قبل جمع البيانات.

انتظر من 10 إلى 20 دقيقة حتى يتم تسجيل درجة حرارة شبكية العين ووظيفة استقرار استجابات الفلاش من النوع البري الداكن C 57 الأسود ستة شبكية العين باستخدام حلول وفرة قياسية مختلفة. بدت أشكال موجات الاستجابة والحركية متشابهة في وسائط ames وفي وسائط الأقفال. كانت حساسية المستقبلات الضوئية قضيب متشابهة أيضا.

من ناحية أخرى ، في أكوام محلول الرنين المخزن بدون استجابة البيكربونات أو الكربوجين ، كانت السعات أصغر بكثير. غالبا ما كان استقرار BWA معرضة للخطر في جرس الكومة. أدت إضافة 40 ميكرومولار من A PB إلى إزالة الموجة B الموجبة بكفاءة.

كشف هذا عن موجة سلبية كبيرة وبطيئة تعزى إلى نشاط خلية مولر ، مضيفا 100 ميكرومولار من الباريوم تم إلغاؤها. يكشف هذا المكون عن استجابة المستقبلات الضوئية لإشارة EG خارج الجسم الحي. يمكن دمج هذه الطريقة مع أدوات أخرى مثل علم الأدوية وعلم الوراثة للإجابة على أسئلة حول الآليات الجزيئية لإشارات الشبكية وأمراض العمى في الثدييات ، بما في ذلك شبكية العين البشرية.