تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية عزل وزراعة العقد الثلاثية التوائم وبراعم الأسنان النامية معاً في مزرعة مشتركة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعقيم الأجهزة الموائعية الدقيقة وتثبيتها وطلائها. وتتمثل الخطوة الثانية في تشريح العقد الثلاثية التوائم وبراعم الأسنان من مرحلة نمو محددة في الفأر المستهدف.

بعد ذلك، يتم وضع العقد الثلاثية التوائم وبراعم الأسنان في الأجهزة الموائع الدقيقة واستزراعها معاً. وتتمثل الخطوة النهائية في تثبيت الخلايا وصبغها باستخدام التألق المناعي. وفي الختام، يُستخدم المجهر لإظهار نمط التعصيب الناتج عن الاستزراع المشترك.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المزارع المشتركة التقليدية، في أنها تسمح بالزراعة المشتركة لأعضاء وأنسجة مختلفة، بحيث يكون كل منها في وسط زراعي مثالي خاص به. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الابتكار الاصطناعي، مثل دور الجزيئات المختلفة في ابتكار الأسنان ودور الابتكار في تطور السن. ابدأ بتعقيم أدوات التشريح باستخدام الموصدة (autoclave)، والتي تشمل ملقط تشريح دقيق ومقصاً.

بعد ذلك، قم بتعقيم مجموعة من شرائح التغطية الزجاجية مقاس 24 مليمتر في 24 مليمتر عن طريق وضعها في محلول من حمض الهيدروكلوريك بتركيز one molar على هزاز مداري عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم اغسل شرائح التغطية ثلاث مرات بماء مقطر معقم، يلي ذلك شطفها ثلاث مرات في 99%Ethanol، ثم جففها تحت غطاء تدفق معقم؛ وبمجرد جفافها، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) في الغطاء لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، احفظ شرائح التغطية في 70%ethanol حتى يحين وقت استخدامها.

بعد ذلك، استخدم ملاقط معقمة لإزالة أجهزة الموائع الدقيقة لعزل المحاور العصبية بعناية من تغليفها، ثم ضعها في طبق بتري معقم باستخدام خرامة خزعة معقمة بمقاس 1 mm. قم بعمل ثقب واحد في الأجهزة لكل عينة، بحيث يكون مقابل حجرات المزرعة.

احذر من الثقب بالقرب من الأخاديد الدقيقة لأن الضغط قد يؤدي إلى تلفها. بعد ذلك، قم بتعقيم الأجهزة عن طريق غمرها في ethanol بتركيز 70%، مع الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء المحتبسة.

بعد ذلك، أخرج الأجهزة من الإيثانول وجففها تماماً تحت غطاء تدفق معقم. كذلك، أخرج شرائح التغطية من محلول الإيثانول 70% واتركها لتجف تحت غطاء التدفق المعقم. انتظر لمدة ثلاث ساعات كحد أدنى قبل المتابعة.

ضع كل شريحة غطاء في فجوة ضمن طبق سداسي الفجوات. بعد ذلك، ضع الجهاز الموائع الدقيقة فوق شريحة الغطاء واضغط برفق ولكن بإحكام باستخدام الملقط للسماح بالالتصاق الكامل بين جهاز العزل وشريحة الغطاء الزجاجية. بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة 150 µL من poly D lycine بتركيز 0.1 mg/mL إلى كل غرفة من غرف الزرع.

ثم ضع الأجهزة الموائعية الدقيقة تحت تفريغ هوائي لمدة خمس دقائق لإزالة كل الهواء من الحجرات. إذا كان لا يزال من الممكن رؤية الهواء داخل الحجرات، كرر إضافة محلول poly D lysine إلى الحجرات.

قم بحضن الأجهزة مع poly de lysine طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، اغسل الغرف ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم، ثم املأ الغرف بـ 150 µL من محلول العمل lamin بتركيز 5 µg/mL، واحضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتحضير أوساط الزراعة لعقد العصب ثلاثي التوائم ومزارع برعم السن كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

نظف منطقة التشريح والمجاهر المجسمة (stereoscope) باستخدام الإيثانول 70% وجهز أدوات التشريح بعد عملية القتل الرحيم. قم بتشريح الجلد حول أسفل بطن فأرة حامل تحتوي على أجنة فئران في المرحلة E 14.5 إلى E 17.5. ثم افتح البطن بعناية باستخدام المقص.

حدد موقع الرحم، ثم قم بإزالته ووضعه في أنبوب مملوء بالثلج. وباستخدام محلول PBS بارد، قم بتشريح الأجنة ووضع كل جنين على حدة في طبق بتري جديد مملوء بمحلول PBS بارد جداً. وبمجرد إزالة جميع الأجنة من الأنسجة خارج الجنينية، قم بفصل الرؤوس باستخدام المقص.

افصل الفك السفلي عن بقية الرأس باستخدام مقصات التشريح الدقيق، مع الحرص على عدم إتلاف العقد الثلاثية التوائم. بعد ذلك، خذ الرأس وضعه في طبق بتري زجاجي مبرد مخصص للتشريح. استخدم الملاقط لإزالة الجلد والجمجمة.

ثم ضع الملقط أسفل الرأس (cephalon) وارفعه. لإزالة الرأس والمخيخ، حدد موقع العقد الثلاثية التوائم (trigeminal ganglia) واستخدم الملقط وإبر التشريح لفصل العقد الثلاثية التوائم عن الأعصاب الثلاثية التوائم وتنظيف العقد. احفظها في محلول PBS بارد باستخدام إبر التشريح كسكاكين.

قم بإزالة اللسان والجلد المحيط بالفك. افصل نصفي الفك الأيسر والأيمن عن طريق القطع على طول الخط الناصف للفك. بعد ذلك، حدد مواقع براعم الأسنان واعمل على عزلها باستخدام إبر التشريح. وبعد تشريح العقد الثلاثية التوائم وبراعم الأسنان، قم بإزالة اللامينين من الأجهزة الموائع الدقيقة واملأ الغرف بـ 200 microliters من الأوساط الغذائية المناسبة.

باستخدام الملاقط، انقل بلطف العقد الثلاثية التوائم المشرّحة وبراعم الأسنان إلى الثقوب التي تم إنشاؤها باستخدام مخرز الخزعة. تأكد من عدم طفو براعم الأسنان وأنها تغوص حتى تلامس شرائح التغطية. يتم استزراع العينات في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide.

قم بتغيير وسط الزرع كل 48 ساعة لمدة 10 أيام لتجديد الوسط. أولاً، قم بإزالة الوسط بتوجيه الماصة نحو الجانب الخارجي من الآبار. بعد ذلك، أضف الوسط الجديد المسخن مسبقاً على جانب الآبار المقابل للغرف خلال فترة الزرع.

قم بتصوير المزارع المشتركة في أي وقت باستخدام المجهر الضوئي. بعد فترة الزراعة، اغسل الحجرات عن طريق سحب وإضافة 150 µL من PBS في بئر واحدة لكل حجرة، وترك PBS يتدفق عبر الحجرات. كرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالاً بعد الغسلة الأخيرة.

قم بإزالة PBS وتثبيت العينات عن طريق نقل 150 µL من paraform aldehyde بتركيز 4% في PBS إلى بئر واحد لكل غرفة، والسماح للمحلول بالتدفق إلى الغرفة الأخرى. يتم تحضين الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، اغسل الغرف مرتين باستخدام PBS وانتقل إلى التحاليل اللاحقة مثل التصبيغ المناعي الفلوري وتصوير النمو الخارجي.

خلال الزراعة المشتركة، تتفرع الاستطالات العصبية من العقد الثلاثية من حجرة زراعتها وتمتد نحو برعم السن النامي. وعند تكبير أعلى، يمكن رؤية الاستطالات العصبية وهي تمتد عبر غرف المحاور والأخاديد الدقيقة في الجهاز الموائع الدقيقة. ويمكن تتبع تقدم النمو العصبي بمرور الوقت لوصف تطور الابتكار.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل RNA أو البروتينات (PROTEINIZATION) من أجل دراسة تغيرات التعبير الجيني أو إفراز البروتين في الأنسجة المستهدفة بعد الابتكار، على سبيل المثال.