توليد الوصلات العصبية العضلية باستخدام جهاز الموائع الدقيقة

ابدأ بجهاز ميكروفلويد مطلي بالبوليمر يتميز بآبار مترابطة تحمل مقصورات عاكسة متصلة عبر الأخاديد الدقيقة.

بذر الخلايا السلفية العصبية في آبار مقصورة واحدة.

اسمح لهم بالهجرة إلى القناة المترابطة والالتصاق بالبوليمر.

تراكب مع وسيط نمو لتعزيز نضوج الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الحركية.

في المقصورة المقابلة ، قم بزرع الآبار بخلايا سلفية عضلية ، والتي تهاجر وتلتصق بالقناة المترابطة.

استبدل الوسط بوسط تمايز ، مما يؤدي إلى اندماج الخلايا السلفية العضلية وتشكيل خلايا عضلية متعددة النوى.

أضف وسط تمايز الخلايا العصبية الذي يحتوي على عوامل النمو إلى الحيز المحتوي على الخلايا العضلية.

وفي الوقت نفسه ، أضف نصف حجم من الوسط الخالي من عامل النمو إلى الحيز المحتوي على الخلايا العصبية.

تعمل عوامل النمو والحجم الأكبر من الوسط في المقصورة المقابلة على تعزيز الخلايا العصبية الحركية لتوسيع عملياتها عبر الأخاديد الدقيقة.

ثم تتصل هذه العمليات العصبية بخلايا العضلات ، وتشكل تقاطعات عصبية عضلية.

لطلاء الخلايا السلفية العصبية ، أو الشخصيات غير القابلة للعب ، في جهاز الموائع الدقيقة ، قم بإزالة DPBS من بئرين على جانب واحد من الأخاديد الدقيقة في الجهاز باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. لزرع ما مجموعه 250,000 غير قابلة للعب في 60 إلى 100 ميكرولتر من اليوم 10 وسط الخلايا العصبية الحركية لكل جهاز في أعلى البئر الأيمن ، بذرة نصف تعليق الخلية بالقرب من فتحة القناة بزاوية 45 درجة.

توقف مؤقتا لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية بالتدفق عبر القناة قبل إضافة النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي. استخدم قلما لتمييز الجانب المصنف على أنه NPC أو ما يعادله لسهولة توجيه الجهاز بدون مجهر واحتضانه لمدة خمس دقائق لتوصيل الخلية. بعد ذلك ، قم بتعبئة الآئرين المصنفين بذرة NPC بمتوسط إضافي للخلايا العصبية الحركية لمدة 10 أيام إلى حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة DPBS من البئرين على الجانب الآخر من الأخاديد الدقيقة المقابلة لغير القابلة للعب المصنفة حديثا.

أضف 200 ميكرولتر من وسائط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 10 لكل بئر إلى الآبار غير المزروعة. ثم أضف 6 ملليلتر من DPBS لكل طبق طوله 10 سم حول الجهاز لمنع تبخر الوسط أثناء الحضانة.

لتغيير الوسيط، قم بإزالة الوسائط ببطء في كلا الآئرين اللذين تحتوي على NPCs عن طريق وضع طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر عند الحافة السفلية لجدار البئر مقابل فتحة القناة. لمنع التدفق المتوسط القوي من إتلاف الخلايا في القناة ، أضف ببطء 50 إلى 100 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الحركية الجديدة إلى كل بئر ، عن طريق التغيير المستمر بين البئر العلوي والسفلي. كرر العملية حتى يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من المتوسط.

في اليوم 17 من تمايز الخلايا العصبية الحركية ، قم بإزالة وسط الخلايا العصبية الحركية على الجانب غير المصنف من الأخاديد الدقيقة في الجهاز باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر واغسل الآبار باستخدام DPBS. قم بزرع ما مجموعه 200,000 من الخلايا المتوسطة الوعائية الأولية البشرية أو MABs في 60 إلى 100 ميكرولتر من وسط النمو لكل جهاز عن طريق زرع نصف تعليق الخلية في البئر العلوي.

توقف مؤقتا لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية بالتدفق عبر القناة قبل زرع النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي ، كما هو موضح سابقا لطلاء الشخصيات غير القابلة للعب. احتضن الجهاز لمدة خمس دقائق لربط الخلية. بعد ذلك ، قم بتعبئة البئرين الطازجين بذرة MAB بوسط نمو إضافي واحتضانه مرة أخرى كما هو موضح.

لبدء التدرج الكيميائي والحجمي في اليوم الحادي والعشرين من تمايز الخلايا العصبية الحركية ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية التي تحتوي على عوامل نمو إلى حجرة الأنبوب العضلي. ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية بدون عوامل نمو إلى حجرة الخلايا العصبية الحركية.