الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الأشواك التغصنية في العصبونات الطرفية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات وقياسها كمياً في ثلاثة أبعاد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق معالجة شرائح التغطية في أطباق ذات ستة آبار باستخدام البولي يوريثين واللامينين لاستزراع الخلايا الجذعية العصبية. بعد ذلك، يتم تخفيف الخلايا الجذعية العصبية في الوسط الزرعي.

يتم توزيع الوسط في الأطباق باستخدام حركة دائرية لطيفة بالماصة، وتُترك الخلايا لتتمايز في المزرعة لمدة تصل إلى 70 يوماً. ومن خلال تجديد الوسط بانتظام، يتم نقل GFP lentivirus إلى الخلايا، ثم تُصبغ بالأجسام المضادة anti GFP ويتم تصويرها. وفي النهاية، يتم تثبيت المزارع وتصوير الأشواك الشجرية باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy).

في نهاية المطاف، يتم إعادة بناء بيانات الصور للأشواك التغصنية البشرية ثلاثية الأبعاد لتصنيفها وقياسها كمياً. يوفر هذا البروتوكول إجراءً تدريجياً للحصول على العصبونات الجلوتاماتيرجية في الطبقات من الثانية إلى الرابعة من قشرة الدماغ البشري. ويتضمن ذلك استخدام الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات والتي تنشأ من الخلايا الليفية البشرية بناءً على الطريقة المنشورة سابقاً.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية في أنها تسمح بالتجزئة التلقائية لـ DON right و PY في الأبعاد الثلاثية (3D). ويتحقق ذلك مع توفير ملحوظ في الوقت مقارنة بالبرمجيات الحالية، والتي عادة ما تعتمد على تحليل ثنائي الأبعاد (2D) فقط. كما أن تصنيفات donr و spy عملية وسهلة الاستخدام للغاية.

لتحضير المزارع العصبية، ضع شرائح غطاء زجاجية في أطباق زراعة ذات ستة آبار وأضف poly ornithine ثم حضنها طوال الليل تحت غطاء التدفق الصفائحي. في اليوم التالي، استخدم DPBS لغسل الشرائح ثلاث مرات ثم أضف laminin وحضنها تحت غطاء التدفق الصفائحي لمدة 10 ساعات على الأقل. قم بتحضير وسط الزراعة الذي يحتوي على المكونات التالية.

بعد ذلك، استخدم الوسط لزراعة وتوزيع الخلايا الجذعية العصبية أو NSCS بكثافة 50,000 خلية لكل سنتيمتر مربع، مع استخدام الماصة بحركات دورانية بطيئة للحد من تكتل الخلايا من أجل نقل الجينات إلى العصبونات المشتقة من خلايا IPSC البشرية. وفي أي مرحلة من مراحل النضج، أضف ميكرولتر واحد من محلول مركز يحتوي على 40 نانوجرام من الناقل اللينتيفيروسي GFP لكل بئر زراعة يحتوي على وسط زراعة طازج، ثم قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ولتجهيز الخلايا للفحص المناعي الفلوري، قم بإزالة وسط الزراعة واستخدم 4% formaldehyde لتثبيت الخلايا المنقولة جينياً في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، استخدم XPBS لغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. ثم اغمر شرائح التغطية في PBS مضاف إليه 0.05%Triton X 110%horse serum واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم استخدم PBS لغسل شرائح التغطية ثلاث مرات.

أضف مضاد GFP الأولي بتخفيف 1/1000 في 100 µL من محلول PBS الذي يحتوي على 4% من مصل الحصان إلى كل شريحة غطاء. تُحضن الشرائح في صندوق مظلم عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد ذلك، يتم تخفيف الجسم المضاد المقترن بـ Alexa Fluor 488 بنسبة 1:200 في محلول PBS الذي يحتوي على 0.5% من tween 20، وتُحضن الخلايا مع محلول الجسم المضاد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد غسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام محلول PBS.

استخدم وسط التثبيت لتثبيت الشرائح من أجل الفحص بالمجهر الفلوري. وباستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، اختر ما لا يقل عن 10 عصبونات سليمة لكل حالة ذات مورفولوجيا شبه معدنية وتفرعات شجيرية مطوية لقياس 60 إلى 100 micrometers لكل تغصن شجيري. التقط الصور باستخدام عدسة زيتية بقوة 40 x na, 1.3 وليزر بطول موجي 488 nanometer وبقدرة ذروة نموذجية عند مستوى العينة تبلغ حوالي 20 micro watts، مع ضبط حجم البكسل عند حوالي 80 nanometers لضمان أخذ عينات دقيقة من الأشواك الشجيرية.

لأخذ عينات من كامل حجم العصبون، يتم الحصول على مكدس Z (Z stack) بتباعد Z يتراوح من 150 إلى 300 nanometers، مما ينتج عنه 20 إلى 30 شريحة Z لإجراء القياس الكمي ثلاثي الأبعاد للأشواك التغصنية. استخدم الإعدادات التالية في برنامج التحليل لعملية المعالجة المسبقة: استخدم ترشيح غاوس (Gaussian filtering) عبر اختيار تنعيم معالجة الصور باستخدام مرشح غاوس (Gaussian filter).

اضبط عرض المرشح ليكون مساوياً لحجم البكسل في المستوى XY لإجراء تتبع شبه تلقائي للزوائد الشجرية باستخدام وحدة تتبع الخيوط (filament tracer). وفي علامة تبويب الشريحة (slice)، استخدم أداة المسافة لتقدير قطر الزائدة الشجرية. بعد ذلك، في علامة تبويب التجاوز (surpassed)، انقر فوق أداة الخيوط (filaments) واختر "تخطي الإنشاء التلقائي" (skip automatic creation) لضمان قوة أداء أفضل في علامة تبويب الرسم (draw).

الآن، اختر auto path كطريقة، وdendrite كنوع، وأدخل القطر التقديري للـ dendrite. باستخدام وضع التحديد للمؤشر، حوّل المؤشر إلى مربع، ثم اضغط على مفتاح shift مع النقر بزر الفأرة الأيمن على نقطة بداية الـ dendrite. سيقوم البرنامج بإجراء الحسابات الأولية.

قم الآن بتحريك المؤشر على طول التغصن بدءاً من نقطة البداية. يظهر خط أصفر يمثل المسار الأكثر احتمالاً للتغصن. اضغط على مفتاح shift والسهم الأيسر.

انقر على الطرف النهائي للشجيرة لتنفيذ تقسيم تلقائي للأشواك في واجهة الوحدة. انقر على علامة تبويب الإنشاء في القائمة المنسدلة لإعادة البناء. اختر إعادة بناء قطر الشجيرة وحدد مربع الاحتفاظ بالبيانات.

انقر بعد ذلك على إعادة البناء (rebuild). اضبط العتبة بحيث يتوافق الحجم المجزأ مع الحجم الفعلي للتغصن الشجري. اختر "أقصر مسافة من خريطة المسافة" (shortest distance from distance map) كخوارزمية.

بعد ذلك، انقر على زر التالي الموجود أسفل علامة تبويب الشريحة، وحدد أصغر قطر للشوكة، وقطر الرأس، والطول الأقصى. ثم تحت علامة تبويب التجاوز، أدخل قيم المعلمات؛ وتعتبر القيم التي تتراوح بين 200 إلى 300 nanometers للقطر الأدنى وأربعة micrometers للطول الأقصى نقاط بداية جيدة، دون تحديد مربع السماح بالأشواك، ثم انقر على زر التالي. بعد ذلك، اضبط عتبة نقاط البذر بحيث تتركز النقاط الزرقاء التي تمثل الأشواك في رؤوس الأشواك الفعلية.

بعد ذلك، انقر فوق "التالي". سيتم الآن إجراء الحساب الأساسي وقد يستغرق الأمر بعض الوقت لتصنيف الأشواك؛ من علامة تبويب الأدوات في واجهة الوحدة، انقر فوق "تصنيف الأشواك". بعد التحقق من وجود أربعة فئات كما هو موضح في البروتوكول النصي، ستقوم واجهة الوحدة بإنشاء أربعة كائنات خيطية جديدة تتضمن نتائج التصنيف.

أخيرًا، قم بتصدير البيانات الإحصائية من علامة تبويب الإحصائيات (statistics) من خلال النقر على "تصدير جميع الإحصائيات إلى ملف" (export all statistics to file). يوضح هذا الشكل مستنبتًا للخلايا العصبية البشرية الموسومة بجسم مضاد لـ beta three tubulin. كما يتضح هنا أيضًا الميل نحو تكتل الخلايا.

يظهر هنا عصبون باراميتالي (parametal neuron) مُعلم ببروتين GFP بعد 40 يوماً من التمايز من سلف قشري متأخر. من الطبقات القشرية السطحية. وتُظهر الصورة المُدرجة تكبيراً أقل يوضح جسم الخلية الظاهر.

تمثل هذه اللوحات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لأجزاء من الأشواك التغصنية في مراحل مختلفة من النضج. ويظهر هنا التحليل الكمي لكثافة الأشواك وحجم رأس الشوكة. وكما هو متوقع، تزداد هاتان المعلمتان بمرور فترة الزرع.

أثناء محاولة إجراء عملية الزرع، من المهم توزيع ونشر الخلايا الجذعية العصبية بعناية فائقة، وذلك عن طريق إضافة الخلايا ببطء مع حركة دورانية لطيفة للحد من تكتل الخلايا. وبالفعل، تتطلب هذه الطريقة القدرة على تحديد العصبونات الفردية.