العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على جزء غير نووي غني بمقصورات التضاعف المتكونة في الخلايا المصابة بالفيروس الغدي (adenovirus) لإجراء دراسة تفصيلية لتكوينها وبنيتها الدقيقة والأنشطة المرتبطة بها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في معالجة أسئلة رئيسية في مجال فيروسات DNA، مثل دراسة الآليات الجزيئية التي تتحكم في تضاعف الجينوم الفيروسي وتعبيره، والتي تعتمد بدورها على مقصورات التضاعف لتنظيم التفاعلات بين الفيروس والخلية المضيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها إجراء بسيط يعتمد على تدرج السرعة لإنشاء نظام خالٍ من الخلايا يكون قابلاً لدراسة الآليات التي تسمح لفيروسات DNA المتضاعفة نووياً بالسيطرة على الخلية المصابة.

لإجراء هذا المقايسة، قم أولاً بتحضير الفيروس الغداني من النوع الخامس (adenovirus type five) أو A5، والخلايا الليفية لالقلفة البشرية (human foreskin fibroblasts) أو HFF كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب؛ للبدء، قم بإصابة 10⁷ من خلايا HFF في أطباق زراعة أنسجة مقاس 100 ملم باستخدام 1 مل من DMEM لكل طبق وبمعدل عدوى (MOI) يبلغ 30 وحدة تشكيل بؤري (FFU) لكل خلية. قم بتحضين الخلايا لمدة ساعتين في حاضنة زراعة خلايا رطبة عند 37 °C و5% CO2، مع هز الأطباق بعناية كل 15 دقيقة لضمان التوزيع المتجانس للقاح الفيروسي فوق الخلايا. بعد التحضين، قم بإزالة الوسط وإضافة DMEM جديد.

تُضاف نسبة 10% من FBS، ثم تُحضن الخلايا لمدة 16 أو 24 أو 36 ساعة باستخدام كاشطة الخلايا. تُجمع الخلايا المصابة وخلايا المجموعة الضابطة برفق بعد العدوى، وتُوضع معلقات الخلايا في أنابيب طرد مركزي معقمة على الثلج. يتم عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور (neubauer chamber)، ثم تُفصل الخلايا بجهاز الطرد المركزي عند 220 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا في خمسة مليليتر من محلول PBS البارد جداً، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً وغسلها ثلاث مرات في خمسة مليليتر من محلول PBS البارد جداً، مع التخلص من النواتج العلوية لعملية الغسل من أجل تحلل الخلايا. أعد تعليق كتلة الخلايا في 700 µL من محلول منظم منخفض التوتر البارد جداً مع إضافة مثبطات البروتياز، واترك الخلايا لتنتفخ على الثلج لمدة ثلاث ساعات. وباستخدام مدق تيفلون من النوع A، قم بتجانس الخلايا من خلال 10 إلى 20 ضربة لأسفل.

افحص المستخلص تحت المجهر بشكل دوري كل 20 ضربة لمراقبة تحلل الخلايا. كرر هذه العملية لمدة 80 ضربة تقريباً حتى يتم تمزيق جميع الخلايا بنجاح. بعد ذلك، قم بطرد المتجانس مركزياً عند 300 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.

يُحفظ السائل الطافي عند درجة حرارة 20- درجة مئوية في أنبوب باعتباره الجزء السيتوبلازمي وذلك لإزالة الحطام الخلوي من بقايا النوى. يُعلّق الراسب في 750 µL من محلول السكروز بتركيز 0.25 M (المحلول 1)، ثم تُنقل 750 µL من محلول السكروز بتركيز 0.35 M (المحلول 2) إلى أنبوب طرد مركزي، ويُوضع المتجانس المعاد تعليقه بعناية كطبقة فوق المحلول 2. يتم تدوير وسادة السكروز بسرعة 1400 ×g عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم يُتخلص من السائل الطافي.

أعد تعليق الراسب في 750 µL من المحلول الثاني لتحليل النوى. قم بمعالجة المعلق النووي بجهاز السونيكيشن في حمام موجات فوق صوتية، يتم الحفاظ عليه عند درجة حرارة 4 °C أو أقل، وذلك على شكل نبضتين مدة كل منهما خمس دقائق. تحقق من تحلل النوى باستخدام مجهر الحقل المضيء بين النبضات، وواصل السونيكيشن حتى تتحلل النوى تمامًا.

بعد ذلك، اسحب بالماصة 750 µL من محلول السكروز الثالث بتركيز 0.88 M في أنبوب طرد مركزي، ثم ضع محلول مستخلص النواة فوق المحلول الثالث في طبقة. قم بطرد مستخلص النواة مركزياً عند 3000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. يمثل الجزء الذي حجمه 1.5 mL الجزء السيتوبلازمي النووي، والذي يتم تخزينه عند درجة حرارة -70 °C.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الراسب في 700 µL من المحلول الثاني. هذا هو كسر مقصورة التكرار 85 أو RCF لنواة المضيف، والذي يتم تخزينه أيضاً عند -70 °C. لبدء تحليل التألق المناعي، ضع قطرة بحجم 5 µL من RCF على شريحة زجاجية مطلية بالمحلول الملحي.

اترك القطرة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 500 µL من PBS في قطرة بجانب البقعة وأمل الشريحة لتدفق PBS فوق البقعة. قم بتصريف PBS من الشريحة.

بعد ذلك، قم بحجب بقعة العينة باستخدام 500 µL من PBS المحتوي على 5% bovine serum albumin لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ولإزالة محلول الحجب الزائد، أضف 500 µL من PBS بلطف إلى العينة الموضعة على الشريحة دون السحب بالماصة مباشرة فوق العينة. كرر عملية الغسل ثلاث مرات.

بعد ذلك، أضف 20 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة ضد البروتين الرابط للحمض النووي E two A الفيروسي على بقعة العينة. غطِّ الشريحة لتجنب التبخر واحضنها في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. الآن، اغسل العينة ثلاث مرات بلطف باستخدام PBS يحتوي على 0.02% tween 20.

تجنب السحب والوضع بالماصة مباشرة فوق العينة بعد هذه الغسلات. أضف 20 µL من الجسم المضاد الثانوي للفأر المقترن بـ fluoro four مباشرة على العينة، ثم حضنها عند 4 °C لمدة ساعة واحدة. في غرفة رطبة، أضف 500 µL من PBS مع 0.02% Tween 20 إلى الشرائح، مع تجنب السحب والوضع بالماصة مباشرة فوق العينة مرة أخرى.

ثم أضف 2 µL من محلول التثبيت وضع غطاء شريحة مقلوباً فوق العينة. قم بسد جوانب أغطية الشرائح باستخدام طلاء الأظافر. افحص الشريحة تحت مجهر فلوري باستخدام عدسة شيئية 63 x عند الطول الموجي المطلوب المحدد للفلورو فور المستخدم؛ وتظهر هنا نتيجة التألق المناعي لبروتين E2A المرتبط بـ DNA الفيروسي الغدي أو DBP.

الهياكل التي تحتوي على DBP هي عبارة عن حلقات تضاعف فيروسية (rc) تحت نووية، لاحظ أن E2-ADBP يتركز داخل RC ويظهر باللون الأخضر. بالإضافة إلى ذلك، تم تأكيد إثراء الحمض النووي الفيروسي في RCF عن طريق تقنية PCR من خلال مقارنة RCF والكسر السيتوبلازمي النووي أو NPL عند 24 و36 ساعة بعد الإصابة. وقد وُجد الحمض النووي الفيروسي بشكل انتقائي في RCF وليس في NPL؛ راجع المرجع.

النص المصاحب لتقديم أدلة إضافية على وجود الحمض النووي الفيروسي الغدي MNA في الـ RCF. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ست ساعات من وقت حصاد الخلايا المصابة وحتى عزل الـ RCF إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر الحفاظ دائمًا على العينات مبردة على الثلج ومراقبة خطوات التجانس النووي، والعزل، والتكسير بالموجات فوق الصوتية، وعزل الجزء تحت النووي باستخدام مجهر الحقل المضيء. اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل R-T-P-C-R والمجهر الإلكتروني النافذ لدراسة تنظيم التعبير الجيني الفيروسي المرتبط بمقصورات التكاثر الفيروسي والبنية الدقيقة لهذه الجسيمات. تملك هذه التقنية القدرة على تمهيد الطريق للباحثين في مجال فيروسات أورام الحمض النووي DNA لاستكشاف الآليات الجزيئية التي تغير تنظيم دورة الخلية وتعزز التكاثر الفيروسي في الخلايا البشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مقصورات التكاثر الفيروسي من نوى الخلايا المصابة لإجراء دراسات شكلية ووظيفية وتركيبية لهذه البنى التي يحفزها الفيروس.

لا تنسَ أن العمل مع مؤشر SAN قد يكون خطيرًا، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء واقيات الأذن، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.