بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن ماوس نماذج

الهدف العام من إجراء التشريح هذا هو توضيح كيفية عزل وإعداد أمعاء الفأر لتقنيات التوصيف اللاحقة. يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية المعوية على إعادة ملء الأمعاء بعد إجراء تجريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها باتباع أي تقنية أو أي إجراء أو بعد التلاعب الجيني باستخدام تقنية أقفال كراي ابدأ بوضع فأر بالغ تم قتله رحيم في وضع ضعيف وترطيب الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم باستخدام المقص ، افتح التجويف داخل الصفاق طوليا على طول خط الوسط وقم بتأمين المعدة بالملقط. بعد ذلك ، اقطع الاتصال بالمريء واسحب المعدة برفق لإزالة الأمعاء الدقيقة حتى الزائدة الدودية. ثم اسحب الزائدة الدودية برفق لإزالة الأمعاء الغليظة حتى فتحة الشرج.

بمجرد عزل الأمعاء ، قم بإزالة المعدة في الزائدة الدودية واستخدم حقنة مزودة بطرف ماصة غير حاد لشطف الأمعاء باستخدام PBS مباشرة بعد التنظيف ، وقم بتقطيع الأمعاء إلى ثلاثة أقسام متساوية الحجم وقريبة ومتوسطة وبعيدة. ثم قم بتقطيع كل قسم إلى قطع بحجم سنتيمتر واحد وضع ثلاث إلى خمس أجزاء من الأنسجة في منتصف قطعة من الشريط الجراحي بحجم سنتيمترين في سنتيمترين. في التشكيل الهرمي ، عندما يتم ربط جميع الأنسجة ، أغلق الشريط حول القطع طوليا لتكوين كومة خشبية.

ثم ضع الشريط في وعاء مسطح القاع يحتوي على ما لا يقل عن 10 أضعاف الحجم المحايد والمخزن المؤقت والرسمي والمثبت لحجم الأنسجة ، وقم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية قبل التضمين والتقسيم. بعد التثبيت ، انقل الأنسجة إلى وعاء مسطح القاع يحتوي على 10 أضعاف حجم 70٪ من الإيثانول على الأقل كحجم الأنسجة لإصلاح الأنسجة في Metcon مباشرة بعد التنظيف. قطع الأمعاء إلى ثلاثة أقسام متساوية الحجم كما هو موضح للتو.

ثم ضع كل قسم جنبا إلى جنب على قطعة من ورق الترشيح مقاس 15 × 15 سم واستخدم مقص القوس الزنبركي لفتح الأقسام الموجودة على البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر عند تقسيم جميع الأقسام. انقل ورق الترشيح إلى طبق زجاجي يحتوي على ميتكون طازج لمدة ثلاث إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة في نهاية التثبيت ، واستخدم الملقط لالتقاط نهاية كل قطعة من الأمعاء واحدة تلو الأخرى ، ولف الأنسجة حول الملقط لتشكيل لفائف سويسرية فردية. قم بتأمين كل لفة عن طريق فتح الملقط قليلا وإدخال إبرة قياس 25 عبر الأنسجة.

ثم ضع الأنسجة الملفوفة في وعاء مسطح القاع يحتوي على ما لا يقل عن 10 أضعاف حجم التركيبة المحايدة المخزنة ومثبتة مثل الأنسجة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل المعالجة لتصور الجبل المتساهل الكامل لانفجار الأنسجة. صب الشمع الخام المنصهر الممزوج بالزيت المعدني في أطباق بتري 15 سم. ثم مباشرة بعد شطف الأمعاء بالثلج البارد PBS ، اغسل الأنسجة ب 25 مل من المثبت المثلج البارد.

بعد التثبيت ، قم بتقطيع الأمعاء إلى ثلاثة إلى خمسة أقسام متساوية وضع كل قسم على أحد ألواح الشمع المبردة. قم بتثبيت كل طرف بحيث يتم شد الأقسام قليلا باستخدام خطوط المساريقية في قمم الألواح. تقليم أي مساريق زائد.

ثم استخدم مقص القوس الربيعي لقطع الشجاعة طوليا عند فتحها عند تثبيت جميع الأقسام. غمر الصفائح بما يكفي من مثبت xal لتغطية جميع الأنسجة بعد ساعة على الأقل عند أربع درجات مئوية. استخدم ماصة سعة 25 ملليلتر أو حقنة لإزالة المثبت وغسل المناديل مرة واحدة باستخدام 30 مل من PBS.

ثم قم بتغطية الأقسام ب 30 مل من محلول توحيد DTTD لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول التأليه بماصة أو حقنة سعة 25 مليلتر ، وقم بإغراق الأنسجة ب 30 مل أخرى من PBS. ثم استخدم ماصة خلفية لإزالة المخاط باستخدام PBS بعد الغسيل.

استبدل PBS ب 30 مل من xal للحصول على بقعة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع تحريك لطيف على منصة هزازة في صباح اليوم التالي. إذا ظهرت بقع خضراء زرقاء على الأقسام ، فاستبدل xal ب 30 مل من PBS. بعد ثلاث دقائق من التحريك اللطيف ، اصنع اللفائف السويسرية كما هو موضح للتو وضع الأنسجة في وعاء مسطح ذو فم واسع يحتوي على 10 أضعاف حجم المثبت المناسب على الأقل مثل حجم الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التضمين والتقسيم.

باستخدام المراسل الشرطي ROSA 26 R Laxy ، يمكن ملاحظة إعادة التركيب بنسبة 100٪ بعد ثلاثة أيام من الحث في الأمعاء الدقيقة باستخدام الحمض النووي المستخرج من أسرة الأطفال المعاد تجميعها. أظهر QPCR للأليلات المعاد تجميعها زيادة غير كبيرة في إعادة التركيب داخل نظام التجعد السادس ، ربما بسبب إعادة التركيب في خلايا البانيث التي لم يتم ملاحظتها. باستخدام نظام تجعد ah باستخدام المراسل المتساهل ، أظهر كلا النظامين أيضا فقدانا كاملا للخلايا المعاد تجميعها بعد ثلاثة أيام من الحث.

أشارت بيانات الانقسام الفتيلي و K crypt إلى أن نظام ah H Cree يمكن أن يتعافى على الأرجح بسبب إعادة التوطين بواسطة الخلايا الجذعية المعوية غير المركبة. في تناقض صارخ ، فشل الشرير كري في التعافي على الرغم من احتفاظه بخلايا القبو الظهارية. علاوة على ذلك ، كانت خلايا القبو في الفئران المتدفقة vi Cree Cantin B غير تكاثرية وتفتقر إلى التعبير عن علامة الخلايا الجذعية المعوية.

EM أربعة. على عكس الخبايا الموجودة في الفئران ah cre بالمثل ، خضعت خلايا PTH لموت الخلايا المبرمج بعد حذف Caden b فقط داخل نظام VI Cree. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي 10 دقائق.

من المهم تقليل التأخير لمنع تدهور الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الأمعاء من الفأر لتحليلها في اتجاه مجرى النهر.