بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أنسجة قلبية بشرية مهندسة ذات تكوين خلوي محدد. يمكن لهذه الطريقة معالجة التحديات الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة القلبية، بما في ذلك التحكم في التباين وكفاءات التمايز القلبي وفهم كيفية تأثير أنواع خلايا معينة على الوظيفة الانقباضية للقلب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النتيجة النهائية هي نسيج قلبي بشري مهندس بتكوين محكوم ومحدد.

تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج أمراض القلب لأن الأنسجة المحددة يمكن أن توفر منصة فحص حيوية وطبية حيوية جديدة وذات صلة بيولوجياً، وتكون قادرة على تقييم التدخلات العلاجية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول العلاجات القلبية الجديدة، إلا أنه يمكن استخدام نظام أنسجة القلب البشرية المهندسة أيضاً لفهم آليات العلاج الخلوي للقلب. ابدأ بمزارع الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم أضف 1 mL من 0.04%trypsin-EDTA.

قم بتحضين الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و5%CO2. وأثناء تحضين الخلايا، أضف 12 µL من مثبط ROCK إلى 6 mL من محلول تحييد التربسين. أخرج الأطباق من الحاضنة وأضف 1 mL من محلول التحييد إلى كل بئر من أطباق الستة آبار.

انقل جميع الخلايا من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 ملليلتر. اغسل الآبار الستة جميعاً بحجم قدره 3 ملليلتر من PBS، واجمع غسول الغسيل هذا مع الخلايا في الأنبوب. قم بإجراء الطرد المركزي للأنبوب عند 300 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لترسيب الخلايا.

لتحضير الخلايا لعملية الفرز الخلوي الحي باستخدام تقنية FACS، قم بتحضير محلول الصبغ عن طريق إضافة 5 mL من FBS و 50 µL من مثبط ROCK إلى 45 mL من PBS على الثلج. قم بإزالة الطافي من الخلايا المترسبة وأعد تعليقها في 1.2 mL من محلول الصبغ. انقل 200 µL من الخلايا المعلقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL جديد ومبرد مسبقاً على الثلج.

بعد ذلك، انقل المليلتر الواحد المتبقي من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مليلتر مبرد مسبقاً على الثلج، وأضف 2 µL من أجسام SIRP alpha-PE/Cy7 المضادة و 4 µL من أجسام CD90-FITC المضادة. امزج معلق الخلايا برفق باستخدام ماصة نقل وضع الأنبوب على الثلج. قم بتحضين أنبوبي الـ 50 مليلتر اللذين يحتويان على المجموعة الضابطة السالبة والعينة على هزاز أرجوحي على الثلج عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة.

أثناء حضانة الخلايا، انقل 3 mL من وسط التمايز 2 إلى كل أنبوب من أنبوبي طرد مركزي سعة 15 mL. ثم أضف 3 µL من مثبط ROCK، واحفظ أنابيب جمع FACS هذه على الثلج قبل الاستخدام. بعد ذلك، قم بترسيب الخلايا المصبوغة عند 300 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

ثم اغسلها مرتين باستخدام 10 milliliters من محلول PBS المبرد. أعد تعليق كتلة العينة بلطف باستخدام من واحد إلى ثلاثة milliliters من منظم التلوين الذي يحتوي على DAPI. أضف 500 microliters من منظم التلوين الخالي من DAPI إلى كتلة عينة الضابط السلبي.

قم بترشيح كلا المعلقين الخلويين عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 micron لإزالة التكتلات الخلوية، ثم انقلهما إلى أنابيب FACS من البوليسترين على الثلج. انقل العينات فوراً إلى جهاز فرز الخلايا. ابدأ بعينة ضابطة للتلوين السلبي لتحديد معايير البوابة (gating parameters).

بعد ذلك، أثناء تشغيل الخلايا العينة، قم باختيار مجموعة الخلايا الحية السلبية لصبغة DAPI. اجمع مجموعات الخلايا الإيجابية لـ FITC والإيجابية لـ PE/Cy7 بشكل مستقل عند ضغط 20 PSI. بعد زراعة الخلايا وإعادة تجميعها، كما هو موضح في البروتوكول النصي، أخرج أطباق زراعة الخلايا من الحاضنة وانقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50-milliliter.

اغسل الأطباق باستخدام 3 mL من PBS وانقل سائل الغسل إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 50 mL نفسه. بعد ذلك، أضف 3 mL من 0.04%trypsin-EDTA إلى الأطباق واحضنها عند 37 °C و 5%CO2. وبعد مرور خمس دقائق، افحص الأطباق باستخدام المجهر للتأكد من انفصال الخلايا.

بمجرد انفصال جميع الخلايا، أضف ثلاثة milliliters من محلول تحييد التربسين إلى الأطباق. اخلط بلطف وانقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الأصلي سعة 50-milliliters. اغسل الأطباق بخمسة milliliters من PBS وأضف سائل الغسيل هذا إلى الأنبوب أيضاً.

قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 ml من مصل العجول حديثي الولادة، أو وسط NBS. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ml.

قم بترسيب الخلايا عند 300 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وأزل الطافي. لبدء إنتاج ستة أنسجة قلبية مهندسة، خفف 60.0 µL من مخزون الكولاجين بتركيز 5 mg/mL إلى 3.125 mg/mL باستخدام 1.5 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M، و9.6 µL من 10X PBS، و24.9 µL من الماء فائق النقاء المعقم. من الضروري هنا تجنب إدخال فقاعات الهواء في خليط الكولاجين، حيث أن فقاعات الهواء تخرج ببطء من المحلول اللزج ويمكن أن تعيق تكوين الأنسجة أثناء عملية دك النسيج.

استخدم الماصة لإضافة السوائل على جدار أنبوب سعة 15 milliliter، حيث يتم إضافة 12.0 µL لكل من 10X MEM و 0.2 normal heaps عند pH 9 لتخفيف خليط الكولاجين. بعد ذلك، أضف مصفوفة الغشاء القاعدي إلى خليط الكولاجين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.9 mg/mL وامزج المكونات بلطف. احفظ خليط الأنسجة النهائي هذا على الثلج.

بعد ذلك، انقل مزيج الأنسجة بالكامل إلى كتلة الخلايا وأضف خلايا تكميلية كما هو موضح في البروتوكول النصي. املأ الأنبوب حتى يصل الحجم النهائي إلى 150 microliters باستخدام وسط NBS الخالي من الخلايا وامزجه بلطف. اسحب بعناية 25 microliters من معلق الخلايا باستخدام الماصة وضعها في كل واحدة من الآبار الستة في لوحة قاعدة المفاعل الحيوي.

كرر إجراء الخلط بين كل بئر لإعادة تعليق أي خلايا قد تكون قد ترسبت. انقل نسيجاً واحداً فقط لكل بئر في المرة الواحدة لضمان اتساق الحجم وعدد الخلايا لكل نسيج. وبشكل منفصل، ادفع صفين من مستشعرات القوة المصنوعة من polydimethylsiloxane، أو PDMS، على كلا جانبي إطار البوليسلفون لتشكيل ستة أزواج من القوائم المتقابلة.

اقلب الإطار فوق الصفيحة القاعدية بحيث يدخل زوج واحد من الأعمدة في كل بئر تحتوي على معلق الخلايا. ثم ضع المفاعل الحيوي في طبق قطر 60 مليمتر، وضع هذا الطبق بدون غطائه داخل طبق قطر 10 سنتيمتر. ضع الغطاء على الطبق قطر 10 سنتيمتر وانقل مجموعة المفاعل الحيوي بأكملها إلى حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد ساعتين من التحضين، أخرج وحدة المفاعل الحيوي وأضف 14 milliliters من وسط NBS لتغطية اللوحة الأساسية. أعِد المفاعل الحيوي إلى حاضنة المزارع الخلوية وقم بتغيير نصف الوسط يومياً. وبعد مرور 48 ساعة، ارفع اللوحة الأساسية برفق بضعة مليمترات في كل مرة.

بعد ذلك، أعِد المفاعل الحيوي إلى الوسط بحيث تكون الأنسجة متجهة للأسفل. إذا سقط نسيج من أحد الأعمدة عند إزالة الصفيحة القاعدية، فأعد تثبيت النسيج بلطف على العمود. يؤدي تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى الحصول على مزرعة مختلطة تتكون أساساً من الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية التي تنظم نفسها ذاتياً في تجمعات وتشكل شبكات نابضة بقوة في جميع أنحاء الطبق.

كشف فرز هذه المزارع بواسطة تقنية FACS أن طريقة التمايز هذه تؤدي إلى تكوين مجموعة تحتوي على 65% على الأقل من الخلايا الموجبة لـ SIRP alpha و10% من الخلايا الموجبة لـ CD90. بعد إزالة اللوحة القاعدية، تُترك الأنسجة القلبية البشرية المهندسة، أو HECTs، لكي تتجمع ذاتياً داخل المفاعل الحيوي. وتؤدي أنسجة HECTs الناضجة والمدمجة إلى إزاحة أعمدة استشعار القوة المدمجة بشكل مرئي بمتوسط قوة يتراوح من 5 إلى 15 micronewtons.

تكشف قياسات قوة التشنج عن كيفية تأثير المتغيرات المنعزلة على القوة الانقباضية في هذه الأنسجة المهندسة المحددة. هنا، عند تدعيم الأنسجة بنسبة 10% من الخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية، يُلاحظ تعزيز كبير في القوة الانقباضية عند كل من ترددات التحفيز البالغة 1 هرتز و2 هرتز. وبمجرد إتقان هذه العملية، سيستغرق التمايز حوالي 20 يوماً، وفرز الخلايا حوالي خمس ساعات، وبناء الأنسجة حوالي ثلاث ساعات.

سيلزم سبعة أيام أخرى لضمان التكوين السليم للأنسجة بعد عملية الإنشاء. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، بما في ذلك وسم الخلايا وتدعيم المزيج النسيجي، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتأثيرات تفاعلات خلوية محددة أو لتحديد آليات العلاج الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إنشاء أنسجة قلبية بشرية مهندسة ذات تركيب خلوي معروف ومحكوم.