بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أنسجة قلبية هندسية بشرية ذات تركيبة خلوية محددة. يمكن لهذه الطريقة معالجة التحديات الرئيسية في مجال هندسة أنسجة القلب ، بما في ذلك التحكم في التباين وكفاءات التمايز القلبي وفهم كيفية تأثير أنواع معينة من الخلايا على وظيفة انقباض القلب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النتيجة النهائية هي أنسجة قلبية هندسية بشرية ذات تركيبة خاضعة للرقابة ومحددة.

تمتد عمليات تكرار هذه التقنية نحو علاج أمراض القلب لأن الأنسجة المحددة يمكن أن توفر منصة فحص جديدة وذات صلة بيولوجيا ومسائية حيوية قادرة على تقييم التدخلات العلاجية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لعلاجات القلب الجديدة ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام نظام أنسجة القلب المصمم هندسيا بشريا لفهم آليات العلاج بخلايا القلب. بدءا من مزارع خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وأضف ملليلتر واحد من 0.04٪ تريبسين-EDTA.

احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما يتم احتضان الخلايا ، أضف 12 ميكرولترا من مثبط ROCK إلى ستة ملليلتر من محلول تحييد التربسين. قم بإزالة الألواح من الحاضنة وأضف ملليلترا واحدا من محلول التحييد إلى كل بئر من الألواح المكونة من ستة آبار.

انقل جميع الخلايا من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 ملليلترا. اغسل جميع الآبار الستة بحجم واحد من ثلاثة ملليلتر من PBS واجمع هذا الغسيل مع الخلايا الموجودة في الأنبوب. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لحبيبات الخلايا.

لتحضير الخلايا لفرز الخلايا الحية بواسطة FACS ، قم بإعداد مخزن التلوين عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من FBS و 50 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى 45 مل من PBS على الجليد. قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة وأعد تعليقها في 1.2 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ. انقل 200 ميكرولتر من الخلايا العالقة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مليلتر مبرد مسبقا على الجليد.

بعد ذلك ، انقل المليلتر المتبقي من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مليلتر مبرد مسبقا على الجليد وأضف ميكرولترين من SIRP alpha-PE / Cy7 وأربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة CD90-FITC. امزج معلق الخلية برفق مع ماصة نقل وضع الأنبوب على الجليد. احتضان الأنبوبين سعة 50 مليلتر اللذين يحتويان على عنصر التحكم السلبي والعينة على شاكر هزاز على الجليد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

أثناء احتضان الخلايا ، انقل ثلاثة ملليلتر من وسط التمايز اثنين إلى كل من أنبوبي الطرد المركزي سعة 15 ملليلترا. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من مثبطات ROCK ، وقم بتخزين أنابيب تجميع FACS هذه على الجليد قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بتحبيير الخلايا الملطخة عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

واغسلها مرتين باستخدام 10 مل من PBS المثلج. أعد تعليق حبيبات العينة برفق مع واحد إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتلوين الذي يحتوي على DAPI. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين بدون DAPI إلى حبيبات التحكم السلبية.

قم بتصفية كل من معلقات الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة كتل الخلايا ، ثم انقلها إلى أنابيب البوليسترين FACS على الجليد. أحضر العينات على الفور إلى فارز الخلايا. بدءا من عينة التحكم في التلوين السلبي ، قم بإنشاء معلمات البوابة.

بعد ذلك، أثناء تشغيل خلايا العينة، حدد لمجموعة الخلايا الحية السالبة DAPI. اجمع كل من مجموعات الخلايا الإيجابية FITC و PE / Cy7 الإيجابية بشكل مستقل عند 20 رطل لكل بوصة مربعة. بعد زراعة الخلايا وإعادة تجميعها ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإزالة ألواح زراعة الخلايا من الحاضنة ونقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا.

اغسل الألواح بثلاثة ملليلتر من PBS وانقل الغسيل إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من 0.04٪ تريبسين-EDTA إلى الألواح واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد خمس دقائق ، افحص الصفائح بحثا عن انفصال الخلايا باستخدام المجهر.

بمجرد انفصال جميع الخلايا ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تحييد التربسين إلى الألواح. امزج الخلايا برفق وانقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الأصلي سعة 50 ملليلترا. اغسل الأطباق بخمسة ملليلتر من PBS وأضف هذا الغسيل إلى الأنبوب أيضا.

بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من مصل الأبقار لحديثي الولادة ، أو وسط NBS. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

حبيبات الخلايا عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية. لبدء توليد أنسجة القلب الستة المهندسة ، قم بتخفيف 60.0 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من مخزون الكولاجين إلى 3.125 ملليغرام لكل مليلتر مع 1.5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم المولي ، و 9.6 ميكرولتر من 10X PBS ، و 24.9 ميكرولتر من الماء المعقم فائق النقاء. هنا ، من الأهمية بمكان تجنب إدخال فقاعات الهواء في مزيج الكولاجين لأن فقاعات الهواء بطيئة في الإطلاق من المحلول اللزج ويمكن أن تتداخل مع تكوين الأنسجة أثناء ضغط الأنسجة.

ضع الماصة أسفل جانب الأنبوب سعة 15 مليلتر لإضافة 12.0 ميكرولتر لكل من 10X MEM و 0.2 كومة طبيعية عند درجة الحموضة 9 لتخفيف خليط الكولاجين. ثم أضف مصفوفة الغشاء القاعدي إلى خليط الكولاجين إلى تركيز نهائي يبلغ 0.9 ملليغرام لكل مليلتر واخلطه برفق. قم بتخزين مزيج المناديل النهائي هذا على الثلج.

بعد ذلك ، انقل مزيج الأنسجة بالكامل إلى حبيبات الخلية وأضف خلايا تكميلية كما هو موضح في بروتوكول النص. املأ الأنبوب بحجم نهائي يبلغ 150 ميكرولتر بوسائط NBS خالية من الخلايا واخلطها برفق. قم بتعبئة 25 ميكرولترا من تعليق الخلية بعناية في كل واحد من الآبار الستة في لوحة قاعدة المفاعل الحيوي.

كرر إجراء الخلط بين كل بئر لإعادة تعليق أي خلايا قد تكون قد استقرت. الماصة نسيجا واحدا فقط لكل بئر في كل مرة لضمان حجم وعدد خلية متسق لكل نسجة. بشكل منفصل ، ادفع صفين من polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، وفرض المستشعرات على جانبي إطار البولي سلفون لتشكيل ستة أزواج من الأعمدة المتعارضة.

اقلب الإطار الموجود أعلى لوحة القاعدة بحيث يدخل زوج واحد من الأعمدة إلى كل بئر يحتوي على تعليق الخلية. ثم ضع المفاعل الحيوي في طبق 60 ملم وضع هذا الطبق بدون غطاءه داخل طبق طوله 10 سم. ضع الغطاء على الطبق الذي يبلغ طوله 10 سم وانقل مجموعة المفاعل الحيوي بالكامل إلى حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد ساعتين من الحضانة ، قم بإزالة مجموعة المفاعل الحيوي وأضف 14 مل من وسط NBS لتغطية لوحة القاعدة. أعد المفاعل الحيوي إلى حاضنة زراعة الخلايا وقم بتغيير نصف الوسط كل يوم. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة لوحة القاعدة برفق بضعة ملليمترات في المرة الواحدة.

ثم أعد المفاعل الحيوي بحيث يكون النسيج متجها لأسفل إلى الوسط. إذا سقط نسيج من عمود عند إزالة لوحة القاعدة ، فأعد توصيل الأنسجة برفق بالعمود. ينتج عن تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ثقافة مختلطة من الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية التي تنظم ذاتيا في مجموعات وتشكل شبكات نابضة قوية في جميع أنحاء الطبق.

كشف فرز FACS لهذه الثقافات أن طريقة التمايز هذه تؤدي إلى مجموعة تحتوي على ما لا يقل عن 65٪ خلايا إيجابية ألفا SIRP و 10٪ خلايا إيجابية CD90. بعد إزالة اللوحة الأساسية ، يسمح لأنسجة القلب المهندسة بشريا ، أو HECTs ، بالتجمع الذاتي داخل المفاعل الحيوي. تعمل HECTs الناضجة والمضغوطة على تحويل وظائف استشعار القوة المتكاملة بمتوسط خمسة إلى 15 ميكرونيوتن من القوة.

تكشف قياسات قوة الارتعاش كيف تغير المتغيرات المعزولة قوة الانقباض في هذه الأنسجة الهندسية المحددة. هنا ، عندما يتم استكمال الأنسجة بخلايا جذعية وسيطة بشرية بنسبة 10٪ ، لوحظ تحسن كبير في قوة الانقباض في كل من ترددات السرعة ذات الهرتز الواحد والهرتز. بمجرد إتقانها ، سيستغرق التمايز حوالي 20 يوما ، وفرز الخلية حوالي خمس ساعات ، وبناء الأنسجة حوالي ثلاث ساعات.

ستكون هناك حاجة إلى سبعة أيام أخرى لتكوين الأنسجة بشكل صحيح بعد البناء. بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى ، بما في ذلك وضع العلامات على الخلايا ومكملات مزيج الأنسجة ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتأثيرات تفاعلات معينة بين الخلية والخلية أو لتحديد آليات العلاج الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء أنسجة قلبية هندسية بشرية بتكوين خلوي معروف وخاضع للرقابة.