تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد مستويات البروتين في الموقع في أجنة الفئران قبل الزرع. لذلك تسمح لنا هذه الطريقة بإجراء تحليل عالي الإنتاجية لصور الفحص المجهري متحد البؤر بدقة خلية واحدة بطريقة شبه آلية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد تركيزات البروتين على الصور متحد البؤر حيث توجد كثافة نووية عالية وعندما يريد المرء دراسة عدم التجانس داخل مجموعات الخلايا.

للبدء ، استخدم لهبا مكشوفا على ماصة باستور زجاجية لرسم نهاية شعرية عند الحافة. افركي الطرف البعيد من الماصة برفق على الشعيرات الدموية لكسرها مع إنشاء نهاية حادة. بعد التضحية بأنثى فأرة حامل في اليوم الجنيني المطلوب من التطور ، قم بتعريض أحشاء البطن وفقا لبروتوكول النص وحدد موقع الرحم.

أمسك نهاية عنق الرحم ، واقطع عنق الرحم ، واسحب برفق لأعلى لتمديد قرني الرحم. تقليم الدهون منه ، مع الحرص على عدم اختراق جدار الرحم. قطع فوق قنوات البيض ، أسفل المبايض ، لتحرير الرحم بالكامل ، ووضعها على طبق بتري.

بعد ذلك ، قم بتغطية الرحم باستخدام PBS ، وافصل قرني الرحم عن طريق قطع الطرف القريب على جانبي عنق الرحم. ثم افصل كل قناة بيض عن الرحم عن طريق القطع أسفل البرزخ الذي يربطهما. تحت مجهر التشريح ، استخدم حقنة مل واحدة بإبرة تحت الجلد لطرد الأكياس الأريمية من الرحم إلى وسط التلاعب ، عن طريق إجبار 0.5-1 مل من الوسط عبر كل قرن من فتحة عنق الرحم.

اترك ما يصل إلى دقيقة إلى دقيقتين حتى تغرق الأكياس الأريمية في قاع الطبق بعد التنظيف. ثم حدد موقع الأكياس الأريمية، وباستخدام ماصة الباستور الزجاجية التي يتم التحكم فيها عن طريق الفم بنهاية شعرية، اجمع الكيسات الأريمية وانقلها إلى قطرة جديدة من الوسط. بعد شطف الأكياس الأريمية ، قم بإزالة المنطقة الشفافة باستخدام محلول التيرود الحمضي لغسل الأجنة لفترة وجيزة.

بمجرد أن تصبح المنطقة غير مرئية ، انقل الأكياس الأريمية مرة أخرى إلى وسط التلاعب. اغسل الأكياس الأريمية في درجة حرارة الغرفة PBS ، وقم بإصلاحها عن طريق نقلها إلى 4٪ PFA في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، انقل الأكياس الأريمية مرة أخرى إلى PBS للتخزين عند أربع درجات مئوية.

بعد إجراء imunoflour وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة فم ناعمة لعمل قطرات صغيرة من PBS أو محلول البقع النووية على السطح الزجاجي لطبق زجاجي مقاس 35 مم ، وقم بتغطيتها بالزيت المعدني. ضع الأجنة في القطرات الدقيقة ورتبها بطريقة متسقة ، ويفضل أن يكون ذلك مع وصول تجويف ICM بالتوازي مع السطح الزجاجي ، ثم ضع الطبق على حامل المجهر. لإجراء التخيل متحد البؤر ، استخدم أقل طاقة ليزر توفر نسبة إشارة إلى ضوضاء قوية دون تبييض الفلوروفورات.

اضبط مجموعة الكسب والإيقاف للحصول على أوسع نطاق ديناميكي دون الإفراط في تعريض العينة. سيسهل التقاط معظم نطاق التدرج الرمادي بأكمله اكتشاف الاختلافات الصغيرة في الكثافة بين الصور. اتبع التفاصيل الإضافية الموضحة في بروتوكول النص لتصوير الأجنة عبر المحور Z بأكمله.

اتبع واجهة المستخدم الرسومية لأداة التجزئة المستندة إلى MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation ، أو MINS ، لتحميل صورة متحدة البؤر أو مكدس Z كامل من البيانات الأولية التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر. لعرض نتيجة كل خطوة، انقر فوق الزر "عرض" المقابل. تشير العلامة الصفراء أعلى الزر إلى العملية قيد المعالجة.

تشير العلامة الخضراء إلى اكتمال العملية. قم بتقييم نتيجة خطوة الكشف قبل الشروع في التجزئة. إذا لم تكن مرضية، فقم بتعديل معلمات الكشف وأعد تشغيلها.

من قائمة تشغيل الوضع الدفعي ، انقر فوق إضافة ملفات وقم بتحميل جميع الملفات المراد معالجتها مرة واحدة. انقر فوق بدء تشغيل وضع الدفعات "واسمح بالوقت للبرنامج لمعالجة الملفات. سيتم حفظ إخراج التجزئة في نفس الدليل مثل الملفات الأصلية.

تحديد الإيجابيات الخاطئة مثل الحويصلات موت الخلايا المبرمج أو العناصر الأخرى التي ليست نوى سليمة ولكن ربما تم تحديدها على هذا النحو بواسطة MINS. احذف السجلات المقابلة للإيجابيات الخاطئة من إحصائيات النجوم. ملف CSV.

احتفظ بملف starstatistics. csv الأصلي للرجوع إليه في المستقبل وقم بتحرير نسخة منه فقط. إذا تم تقسيم النواة بشكل مفرط وتقديمها كنواتين أو أكثر ، فقم إما بدمج السجلات عن طريق حساب متوسط مستوى شدتها ، أو الاحتفاظ بأحد السجلات لتلك الخلية وتجاهل الباقي.

للحل تحت التجزئة ، حدد الأحداث التي فشل فيها MINS في اكتشاف الحدود بين نواتين أو أكثر وتقسيمها كنواة واحدة ، أو حيث فشلت في اكتشاف نواة تماما. استخدم ImageJ لقياس متوسط المستوى الرمادي لكل قناة في الخلايا السفلية أو غير المجزأة. بعد ذلك ، ابحث عن قسم وسطي من النواة السفلية أو غير المجزأة على قناة الحمض النووي ، باستخدام أداة الاختيار اليدوية ، وحدد محيط النواة السفلية أو غير المجزأة.

ثم اضغط على Control M "أو انتقل إلى قائمة التحليل" وحدد "قياس" سيؤدي هذا إلى تسجيل متوسط القيمة الرمادية للمنطقة الموضحة وسيعرضها في نافذة جديدة. باستخدام نفس المنطقة المحددة للتو في قناة الحمض النووي ، كرر قياس كل قناة من قنوات التألق ذات الأهمية. سيتم قلب النتائج إلى السابقة في نافذة نتائج القياسات.

ثم استخدم القياسات التي تم الحصول عليها لاستبدال السجلات الخاطئة في ملف starstatistics. csv. إذا كانت النواة مجزأة أقل من الحجم، فقم بتكرار صفها، وقم بتعيين معرفات خلايا مختلفة لكل خلية جديدة، وأدخل القيم التي تم الحصول عليها في ImageJ ضمن العمود المقابل.

في هذه الحالة ، ستشارك كلتا الخليتين الإحداثيات المكانية. عندما يتم النظر في النوى الانقسامية بشكل منفصل في التحليل ، قم بتسجيلها يدويا وإضافة المعلومات إلى ملف البيانات. راجع بروتوكول النص للحصول على إرشادات إضافية لمعالجة الصور.

يوضح هذا الشكل أمثلة على الأكياس الأريمية السليمة في مراحل مختلفة مع تجويف موسع. تظهر هنا أمثلة على الأجسام المضادة الجيدة لعدد من البروتينات النووية ، بما في ذلك CDX2 و GATA4 و GATA6 و NANO و OCT4. تم تصنيف هذه العينة بالبروتين السيتوبلازمي DAB2 الذي يعطي نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.

في هذه اللوحة ، يتم عرض أمثلة على تلطيخ سيئ ل GATA4 مع نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة ، حيث تم تثبيت العينات لمدة 10 دقائق فقط. يتطلب هذا الجسم المضاد المضاد ل GATA4 تثبيتا طوال الليل لتوفير إشارة قوية. تم تصوير هذه الأجنة بهدف غمر الزيت 40x مع NA 1.30 ومسافة عمل 0.21 مم تظهر الألواح الوسطى تكبيرات ICMs أو النوى الفردية ويمكن تمييز الحدود بينهما.

توضح اللوحات السفلية كيف أنه كلما كان الجنين أكثر تقدما ، زادت الكثافة النووية ، وبالتالي زادت فرصة حدوث أخطاء في التجزئة. تظهر هذه الصور الأخطاء التي يمكن أن يرتكبها MINS ، مثل اكتشاف النوى موت الخلايا المبرمج كخلايا حية ، أو أكثر من التجزئة ، أو تحت التجزئة. يكشف هذا التسلسل من شرائح Z عن حدث تجزئة أقل ، حيث تم تحديد خليتين على أنهما خليتان واحدة.

بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام من البداية إلى النهاية ، مع عبء زمني من ساعتين إلى أربع ساعات في اليوم. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون متسقا جدا مع ظروف التجربة ، أي بروتوكولات الفلورسنت المناعي ومعلمات التصوير. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا نمو الفئران لإجراء تحليل كمي في الموقع للتعبير الجيني والبروتيني في الخلايا المفردة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على بيانات الصورة المناسبة لتحليل التعبير الكمي في الموقع.