الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو رسم خريطة لديناميكيات التعبير الجيني المكاني والزماني لساعة تجزئة الفقاريات باستخدام أخذ عينات الأنسجة الثابتة. تسمح هذه الطريقة بتقييم غير متحيز لديناميكيات الجينات التذبذبية في الأديم المتوسط قبل الوخزي ، وهذا أمر بالغ الأهمية لفهم الآليات الجزيئية التي تحكم تكوين الفقاريات الجسدية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء العديد من العينات ومعالجتها في وقت واحد ، مما يسمح بتحليل ثلاثي الأجزاء لديناميكيات التعبير الجيني في الأنسجة الثابتة.

ستظهر الدكتورة شارلوت بيلي ، وهي طالبة سابقة في ما بعد الدكتوراه في مختبري. بعد الحصول على قرن رحم الفأر وفقا لبروتوكول النص ، تحت مجهر ستيريو ، استخدم مقصا منحنيا لقطع الغشاء العضلي السميك لقرن الرحم واستخراج كل جنين بعناية. باستخدام مقص منحني وملقط دقيق ، قم بتشريح الكيس الأمنيوسي من كل جنين.

ثم باستخدام إبرة جراحية أو مقص منحني ، قم بحصاد أنسجة الذيل من كل جنين عن طريق قطع الجنين الأمامي إلى براعم الأطراف الخلفية. موازنة الجانب البطني لأنسجة الذيل لأسفل. ثم قم بإنشاء أزواج من مستخلصات PSM عن طريق تشريح أنسجة الذيل إلى نصفين على طول خط الوسط ، باستخدام حركة هزاز لطيفة بالإبرة.

تأكد من تقسيم الأنبوب العصبي والحبل الظهري وأنسجة PSM بالتساوي بين النباتين. ثم قم بوضع ماصة كل مخرج PSM مقابل على الجانب السفلي من غطاء طبق استزراع بلاستيكي مقاس 35 مم في حجم صغير من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا. ضع الطبق في الجزء العلوي من الغطاء وقم بقلبه بسرعة ، بحيث يتم تعليق أنسجة PSM من الغطاء في قطرة معلقة من المتوسط.

ثم استزراع نباتات PSM في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. نقل أزواج من مستخلصات PSM إلى الآبار الفردية للوحة زراعة أنسجة 24 بئر. ثم أضف 4٪ بارافورمالدهايد في PBS إلى العينات واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، أو عند أربع درجات مئوية على منصة هزازة طوال الليل.

بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل آبار العينة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ناعمة ، قم باستبدال محلول PBS على العينات ثلاث إلى أربع مرات. لإجراء الكيمياء المناعية ، أضف 2٪ Triton X-100 في PBS إلى نبتة PSM واحدة من كل زوج جنيني واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة ساعة واحدة لغسلها.

استخدم PBS لشطف العينات لفترة وجيزة. ثم استبدل PBS بمحلول حجب واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية على منصة هزازة طوال الليل. باستخدام عازلة العمل ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية المطلوبة.

في هذا المثال ، يتم استخدام الأجسام المضادة للدلتا الشبيهة بالدلتا 1 و Notch1 عند تخفيف 1:25. أضف الأجسام المضادة إلى الآلات واحتضان العينات على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل العينات مرتين لمدة خمس إلى عشر دقائق لكل منهما.

ثم قم بإجراء ثلاث غسلات في 0.3٪ Triton X-100 في PBS في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. بعد تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت العامل ، أضف 250-500 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد إلى كل عينة جيدا ، مع الحرص على عدم استخدام آخر بضعة ميكرولترات من المحلول ، والتي قد تحتوي على مجاميع الأجسام المضادة. باستخدام ورق القصدير ، قم بتغطية اللوحة واحتضان العينات في محلول الجسم المضاد الثانوي في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام.

بعد الحضانة ، استخدم PBST لغسل العينات مرتين لمدة عشر دقائق لكل منهما. ثم استخدم PBS لغسل الأنسجة مرة واحدة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة خمس دقائق. باتباع بروتوكول النص ، قم بتجفيف وترطيب مستخلصات PSM المقابلة المتبقية من خلال سلسلة تخفيف الإيثانول PBST.

أضف عشرة ميكروغرام لكل مليلتر من Proteinase K في 0.1٪ PBST إلى النباتات الخارجية ، واحتضان الأنسجة دون تحريض لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة محلول Proteinase K بسرعة واستخدم PBST لشطف العينات لفترة وجيزة. أضف 4٪ فورمالديهايد و 0.1٪ جلوتارالديهايد في PBST إلى مكثفات PSM لتأخيرها واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة.

ثم ، بعد استخدام PBST لغسل العينات مرتين لمدة عشر دقائق لكل منهما ، أضف مزيج تهجين بنسبة 50٪ إلى الأنسجة واحتضانه عند 65 درجة مئوية دون تحريض لمدة عشر دقائق. بعد احتضان العينات ومزيج التهجين وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة المحلول وإضافة 0.25 إلى 0.5 مل من مزيج التهجين الدافئ مسبقا الذي يحتوي على مسبار الحمض النووي الريبي المضاد للحساسية المسمى digoxigenin مقابل مكون ساعة تجزئة معروف. استخدم شريطا لاصقا لإغلاق اللوحة واحتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة ليلتين.

بعد الحضانة ، استخدم مزيج التهجين الدافئ مسبقا بنسبة 50٪ في TBST لغسل العينات لمدة 15 دقيقة. ثم استخدم TBST لشطف العينات مرتين قبل احتضان الأنسجة في TBST في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم باحتضان النباتات المسبقة في محلول مانع لمدة ساعتين على الأقل.

ثم استبدل المحلول بمحلول حجب جديد يحتوي على تخفيف 1: 200 من الجسم المضاد المضاد للديجوكسيجينين المترافق HRB. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم TBST لشطف العينات ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى آبار فردية للوحة زراعة أنسجة جديدة 24 بئر.

ثم باستخدام TBST ، اغسل النباتات ثلاث مرات لمدة ساعة واحدة لكل منها. استخدم مجموعة تضخيم إشارة التيراميد لرؤية الرنا المرسال المكتشف قبل تحضير العينات للتصوير. قم بإعداد شريحة زجاجية لاصقة مشحونة لكل زوج من النباتات عن طريق إزالة البطانة اللاصقة من فاصل تصوير بسمك 0.12 مم وإلصاقها على شريحة زجاجية.

بعد وضع زوج أو مكثفات على الشريحة وفقا لبروتوكول النص ، اسمح للعينات بالالتصاق بالشريحة لمدة 45-60 ثانية ، حتى تبدأ الأنسجة في الظهور لزجة وشفافة دون أن تجف تماما. في غضون ذلك ، استخدم الملقط لإزالة البطانة اللاصقة المتبقية من الفاصل وإضافة قطرة كبيرة من وسيط التثبيت ثنائي الوظيفة ومحلول المقاصة إلى العينات الموجودة في وسط الفاصل. ضع غطاء دائريا عبر العينات مع التأكد من توزيع وسط التثبيت بالتساوي وأن جميع الحواف تتلامس مع المفاصل.

ثم ضع شريحة الغطاء رأسا على عقب على بعض ورق الوبر المنخفض. اضغط لأسفل بقوة للتأكد من أن الغطاء يلتصق تماما بالفاصل وإزالة أي وسيط تركيب زائد. كرر هذه العملية حتى لا يؤدي المزيد من تركيب الوسائط إلى لطخة الورق.

قم بتنظيف الشريحة وتسميتها وتخزينها في الظلام حتى التصوير. ثم قم بإجراء التصوير والتحليل وفقا لبروتوكول النص. في هذه التجربة ، يظهر تعبير البروتين Delta-Like 1 و Notch1 أنه يتأرجح خارج التزامن عن طريق ترتيب الأجنة مؤقتا وفقا للنسخ الناشئ لجين ساعة التجزئة المنظم من Notch الهامش المجنون الداخلي المكتشف في نصف كل زوج من النبات.

يتم ترتيب اللوحات وفقا للمرحلة الأولى والثانية والثالثة من دورة ساعة التجزئة. يتم تحديد مدى مجالات التعبير ل Delta-Like 1 و Notch1 والهامش المجنون الداخلي على طول المحور الأمامي الخلفي ل PSM بواسطة أشرطة مشفرة بالألوان. كما هو موضح هنا ، يتم إنشاء مخطط لتحديد كثافة إشارة Delta-Like 1 و Notch1 و intronic الهامشية المجنونة فيما يتعلق بالمحور الأمامي الخلفي ل PSM وتوضح التباين المحوري وشدة الإشارة عبر PSM طوال دورة الساعة.

تصور التصوير الدائري التوزيع المكاني ل Delta-Like 1 و Notch1 والهامش المجنون الداخلي عبر العديد من PSMs. يمثل كل صف من الصف من الكيموغراف شدة الإشارة لمصنع PSM فردي. يكشف القياس الكمي لكثافة الإشارة الهامشية المجنونة الشبيهة بالدلتا 1 و Notch1 وشدة الإشارة الهامشية المجنونة الداخلية فيما يتعلق بالمحور الأمامي الخلفي ل PSM عن ديناميكيات التعبير التذبذبي الواضحة لهذه الأهداف.

أخيرا ، تظهر هذه الخطوط الكيموغرافية التوزيع المكاني للشكل المشقوق والمنشط لمستقبل Notch NICD ، و Delta-Like 1 ، والهامش المجنون الداخلي ، و Notch1 عبر العديد من PSMs. ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجال تكوين الانقسام الظاهري للفقاريات على فهم ديناميكيات تذبذب الجينات التجزئة بشكل أفضل في الأديم المتوسط الفخم للكتكوت والفأر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية على أعداد كبيرة من العينات مما يسمح بتحليل ملفات تعريف التعبير للعديد من mRNAs والبروتينات ذات الأهمية في وقت واحد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن أن يوفر القياس الكمي الإضافي لبيانات الصورة فهما للتأخير الزمني في التعبير الجيني بالإضافة إلى التوطين الخلوي لكل من الحمض النووي الريبي وإشارات البروتين التي تهم الباحث. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية رسم خريطة لديناميكيات التعبير الجيني المكاني والزماني لساعة تجزئة الفقاريات باستخدام أخذ عينات من الأنسجة السميكة. يمكن أن يتبع ذلك تحليل تلقائي للصور كما هو مفصل في بروتوكول النص.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ضمان التوزيع المتساوي ل PSM ، الحبل الظهري ، والأنبوب العصبي بين مستخلصات PSM وتحسين تخفيفات الأجسام المضادة بعناية قبل البدء. تذكر أن العمل مع الفورماميد وبارافورمالدهايد والجلوتارالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية. احرص على ارتداء معدات الحماية الشخصية والعمل في غطاء الدخان عند الاقتضاء.