الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو رسم خريطة لديناميكيات التعبير الجيني الزمانية والمكانية لساعة التجزئة في الفقاريات باستخدام أخذ عينات من الأنسجة المثبتة. تتيح هذه الطريقة تقييماً غير متحيز لديناميكيات الجينات التذبذبية في الأديم المتوسط ما قبل السوميتية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم الآليات الجزيئية التي تحكم عملية تكوين السوميتات في الفقاريات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إنشاء ومعالجة العديد من العينات في وقت واحد، مما يسمح بتحليل دقيق وعالي الدقة لديناميكيات التعبير الجيني في الأنسجة المثبتة.

ستقوم الدكتورة Charlotte Bailey، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه سابقة في مختبري، بتوضيح الإجراء. بعد الحصول على قرن رحم فأرة وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم مقصات منحنية تحت مجهر ستيريو لقص الغشاء العضلي السميك لقرن الرحم واستخراج كل جنين بعناية. وباستخدام مقصات منحنية وملاقط دقيقة، قم بتشريح الكيس السلوي وفصله عن كل جنين.

بعد ذلك، وباستخدام إما إبرة جراحية أو مقص منحني، يتم استئصال أنسجة الذيل من كل جنين عن طريق قطع الجنين أمام براعم الأطراف الخلفية. يتم موازنة أنسجة الذيل بحيث يكون الجانب البطني للأسفل. ثم يتم تحضير أزواج من مستأصلات الـ PSM عن طريق تشريح أنسجة الذيل إلى نصفين على طول الخط الناصف، باستخدام حركة تأرجح لطيفة بالإبرة.

تأكد من تقسيم الأنبوب العصبي، والحبل الظهري، وأنسجة الميزوديرم قبل القطعية (PSM) بالتساوي بين المستنبتين. بعد ذلك، انقل كل مستنبت PSM متقابل باستخدام الماصة إلى الجانب السفلي لغطاء طبق زراعة بلاستيكي مقاس 35mm في حجم صغير من وسط زراعة مُدفأ مسبقاً. ضع الطبق فوق الغطاء واقلبه بسرعة، بحيث تظل أنسجة PSM معلقة من الغطاء في قطرة متدلية من الوسط.

بعد ذلك، يتم استنبات مزارع PSM في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. تُنقل أزواج من مزارع PSM إلى الآبار الفردية في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً. ثم يُضاف 4% paraformaldehyde في PBS إلى العينات ويُحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو عند أربع درجات مئوية على منصة هزازة طوال الليل.

بعد انتهاء فترة الحضن، استخدم PBS لغسل آبار العينات في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. وباستخدام ماصة باستور بلاستيكية دقيقة، استبدل محلول PBS على العينات من ثلاث إلى أربع مرات. ولإجراء الكيمياء النسيجية المناعية، أضف 2% Triton X-100 في PBS إلى مستنبت PSM واحد من كل زوج جنيني، واحضر العينات في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة ساعة واحدة لغسلها.

استخدم محلول PBS لشطف العينات سريعاً. ثم استبدل محلول PBS بمحلول الحجب واحضن العينات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية على منصة هزازة طوال الليل. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية المطلوبة باستخدام محلول التخفيف.

في هذا المثال، تُستخدم أجسام مضادة لـ Delta-like 1 وNotch1 بتخفيف 1:25. أضف الأجسام المضادة إلى المستنبتات، ثم حضّن العينات على منصة هزازة عند درجة حرارة أربعة °C لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام. بعد انتهاء التحضين، استخدم PBS لغسل العينات مرتين لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق في كل مرة.

ثم قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام Triton X-100 بتركيز 0.3% في PBS في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. بعد تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في محلول التخفيف العامل، أضف 250-500 µL من محلول الأجسام المضادة إلى كل بئر من العينات، مع الحرص على عدم استخدام الميكرولترات القليلة الأخيرة من المحلول، والتي قد تحتوي على تجمعات من الأجسام المضادة. قم بتغطية الطبق برقائق القصدير وحضن العينات في محلول الأجسام المضادة الثانوية في الظلام عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام.

بعد الحضن، استخدم PBST لغسل العينات مرتين لمدة عشر دقائق في كل مرة. ثم استخدم PBS لغسل النسيج مرة واحدة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة خمس دقائق. واتباعاً للبروتوكول النصي، قم بإزالة الماء ثم إعادة ترطيب مستأصلات PSM المقابلة المتبقية من خلال سلسلة تخفيف من الإيثانول في PBST.

أضف 10 µg/mL من Proteinase K في 0.1% PBST إلى المستنبتات، واحضر النسيج بدون تحريك لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة محلول Proteinase K بسرعة واستخدم PBST لشطف العينات لفترة وجيزة. أضف 4% formaldehyde و 0.1% glutaraldehyde في PBST إلى مستنبتات PSM لتثبيتها بشكل إضافي، واترك العينات لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، وبعد غسل العينات مرتين باستخدام PBST لمدة عشر دقائق في كل مرة، أضف 50% من مزيج التهجين إلى النسيج واتركه يحضن عند 65 درجة Celsius بدون تحريك لمدة عشر دقائق. وبعد تحضين العينات ومزيج التهجين وفقاً للبروتوكول النصي، قم بإزالة المحلول وأضف من 0.25 إلى 0.5 milliliters من مزيج تهجين مسخن مسبقاً يحتوي على مسبار RNA مضاد للمعنى وموسوم بالديجوكسيجينين ضد مكون معروف من ساعة التجزئة. استخدم شريطاً لاصقاً لإغلاق الصفيحة، ثم حضن العينات عند 65 درجة Celsius لمدة ليلتين.

بعد انتهاء فترة الحضانة، استخدم خليط تهجين بتركيز 50% مُسخن مسبقاً في TBST لغسل العينات لمدة 15 دقيقة. ثم استخدم TBST لشطف العينات مرتين قبل تحضين الأنسجة في TBST في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحضين المستنبتات مسبقاً في محلول الحجب لمدة لا تقل عن ساعتين.

بعد ذلك، استبدل المحلول بمحلول حجب جديد، يحتوي على تخفيف بنسبة 1:200 من الجسم المضاد لـ anti-digoxigenin المقترن بـ HRB. يتم تحضين العينات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخدم TBST لشطف العينات ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة، ثم انقلها إلى آبار فردية في طبق زراعة أنسجة جديد يحتوي على 24 بئرًا.

بعد ذلك، اغسل المستأصلات ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة ساعة واحدة في كل مرة. استخدم طقم تضخيم إشارة التيراميد لتصوير mRNA المكتشف قبل تحضير العينات للتصوير. قم بتحضير شريحة زجاجية واحدة ذات التصاق مشحون لكل زوج من المستأصلات عن طريق إزالة البطانة اللاصقة من فاصل تصوير بسمك 0.12 mm ولصقه على شريحة زجاجية.

بعد وضع زوج من المستأصلات على الشريحة وفقاً للبروتوكول المكتوب، اترك العينات لتلتصق بالشريحة لمدة 45-60 ثانية، حتى يبدأ النسيج في الظهور بمظهر لزج وشبه شفاف دون أن يجف تماماً. وفي هذه الأثناء، استخدم الملقط لإزالة بطانة اللاصق المتبقية من الفاصل، وأضف قطرة كبيرة من وسط التثبيت ومحلول الترويق مزدوج الوظيفة إلى العينات الموجودة في مركز الفاصل. ضع غطاء شريحة دائرياً فوق العينات مع التأكد من توزيع وسط التثبيت بالتساوي ومن تلامس جميع الحواف مع الفاصل.

بعد ذلك، ضع شريحة غطاء الشريحة مقلوبة على بعض الورق الخالي من الوبر. اضغط لأسفل بقوة لضمان التصاق غطاء الشريحة تماماً بالفاصل وإزالة أي زيادة من وسط التثبيت. كرر هذه العملية حتى لا يعود وسط التثبيت يترك بقعاً على الورق.

قم بتنظيف الشريحة ووضع علامة تعريفية عليها، ثم خزنها في مكان مظلم حتى بدء التصوير. بعد ذلك، قم بإجراء التصوير والتحليل وفقاً للبروتوكول النصي. في هذه التجربة، يظهر أن تعبير بروتيني Delta-Like 1 وNotch1 يتذبذب بشكل غير متزامن عن طريق ترتيب الأجنة مؤقتاً وفقاً للنسخ الناشئ لجين ساعة التجزئة المنظم بواسطة Notch وهو intronic lunatic fringe الذي تم اكتشافه في نصف واحد من كل زوج من المستأصلات.

تم ترتيب اللوحات وفقاً للمرحلة الأولى والثانية والثالثة من دورة ساعة التجزئة. تم تحديد مدى نطاقات التعبير لـ Delta-Like 1 وNotch1 وintronic lunatic fringe على طول المحور الأمامي الخلفي لـ PSM بواسطة أشرطة ذات رموز لونية. وكما هو موضح هنا، تم إنشاء مخطط لقياس كثافة إشارة Delta-Like 1 وNotch1 وintronic lunatic fringe فيما يتعلق بالمحور الأمامي الخلفي لـ PSM، وهو يوضح التباين المحوري وكثافة الإشارة عبر PSM طوال دورة الساعة.

توضح المخططات الزمنية المكانية (Kymographs) التوزيع المكاني لكل من Delta-Like 1 وNotch1 وintronic lunatic fringe عبر العديد من القطع الجسدية الأولية (PSMs). ويمثل كل صف في المخطط الزمني المكاني شدة الإشارة لمستنبت خارجي فردي من الـ PSM. ويكشف التحديد الكمي لشدة إشارة Delta-Like 1 وNotch1 وintronic lunatic fringe بالنسبة للمحور الأمامي الخلفي للـ PSM عن ديناميكيات تعبير تذبذبية واضحة لهذه الأهداف.

وأخيرًا، تُظهر هذه المخططات الكيموغرافية (kymographs) التوزيع المكاني للشكل المقطوع والنشط لمستقبل Notch وهو NICD، وDelta-Like 1، وintronic lunatic fringe، وNotch1 عبر العديد من الميزومرات قبل التقطعية (PSMs). وقد ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجال تكوين الخلايا الميتوجينية للفقاريات على فهم ديناميكيات تذبذب جينات التقطيع بشكل أفضل في الميزودرم قبل التقطعي لدى الدجاج والفئران. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها على أعداد كبيرة من العينات، مما يسمح بتحليل ملفات تعبير العديد من mRNAs والبروتينات ذات الصلة في وقت واحد.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن أن يوفر التكميم الإضافي لبيانات الصور فهماً للتأخيرات الزمنية في التعبير الجيني، بالإضافة إلى التموضع تحت الخلوي لكل من إشارات RNA والبروتين التي تهم الباحث. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية رسم خرائط ديناميكيات التعبير الجيني المكانية-الزمانية لساعة تقسيم الفقاريات باستخدام أخذ عينات من الأنسجة السميكة. ويمكن أن يتبع ذلك تحليل آلي للصور كما هو مفصل في البروتوكول النصي.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم ضمان التوزيع المتساوي لكل من PSM والنخاع الشوكي (notochord) والأنبوب العصبي بين مستأصلات PSM، وتحسين تخفيفات الأجسام المضادة بعناية قبل البدء. تذكر أن العمل مع الفورماميد، والبارافورمالدهيد، والجلوتارالدهيد يمكن أن يكون خطيراً للغاية. احرص على ارتداء معدات الوقاية الشخصية والعمل داخل خزانة استنشاق الأدخنة عند الاقتضاء.