البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

هنا نبلغ عن بروتوكولات للكشف عن بروتينات السنترومير الحركية الداخلية والخارجية في الخلايا البشرية وتحديد مستويات البروتين هذه عند السنترومير-الحركية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي غير المباشر من خلال استخدام التثبيت (تثبيت بارافورمالدهيد أو الأسيتون أو الميثانول).

الهدف العام من هذا الاختبار المناعي غير المباشر هو تحسين توطين وقياس بروتينات السنترومير الحركية الداخلية والخارجية ، بما في ذلك بروتين السنترومير A وبروتينات CENP-A الخارجية الموسومة في الخلايا البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تحديد وقياس بروتينات السنترومير الحركية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لقياس مستويات مختلفة من تعبير السنترومير الحركية اعتمادا على الطور المحدد للاهتمام.

بعد 18 ساعة من البذر ، اغسل الخلايا المستنبتة مرة واحدة باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى كل بئر من لوحة زراعة البوليسترين الستة آبار. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا في كل بئر بمحلول خليط A و B المحضر حديثا واحتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد أربع ساعات ونصف ، قم بتغيير DMEM متوسط إلى مرتفع الجلوكوز المكمل ب FBS والمضادات الحيوية وأعد الصفيحة إلى حاضنة زراعة الخلايا.

بعد 48 إلى 72 ساعة ، قم بشفط وسط زراعة الخلايا وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، مع إضافة المحلول الملحي أسفل جوانب آبار الثقافة لتجنب إزعاج الخلايا. ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. في نهاية فترة التثبيت ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت Kb2 وقم باختراق العينات في المخزن المؤقت Kb1 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت Kb2 وقم بحظر أي ارتباط غير محدد بإضافة مخزن Kb2 الجديد. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، استخدم الملقط لإزالة أكواب الغطاء المصنفة من كل بئر ، واستخدم قلم حاجز مسعور لرسم حواجز كارهة للماء حول كل عينة زجاجية للغطاء. انقل أكواب الغطاء إلى صفيحة جديدة من البوليسترين بستة آبار واغمر العينات في الجسم المضاد الأولي المناسب لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

ثم اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت Kb2 وقم بتسميتها بالجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اشطف العينات بخمس غسلات لمدة 6 دقائق في المخزن المؤقت Kb2. ثم قم بتسمية نوى الخلية بمخزن Kb3 الذي يحتوي على DapE لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسلة واحدة أو غسلتين في المخزن المؤقت Kb2 وإعادة ملء الآبار بمخزن Kb2 المؤقت.

الآن ضع قطرة من وسط التركيب في وسط شريحة مجهر واحدة لكل غطاء زجاجي من الخلايا ، وقم بإزالة أي سائل من عينات الخلية. أخيرا ، ضع كل عينة بعناية في وسط إحدى شرائح المجهر المعدة ، وقم بإزالة أي وسيط تركيب زائد بمنشفة ورقية. كما لوحظ في هذه التجربة التمثيلية ، فإن مستويات تعبير بروتين CENP-A الداخلي في محللات الخلايا الكلية للخلايا المنقولة CUL4A siRNA كانت مشابهة لمستويات تعبير CENP-A في الخلايا المنقولة Luciferase siRNA.

علاوة على ذلك ، كانت مستويات البروتين ل CENP-A الداخلية في محللات الخلايا الكلية للخلايا المنقولة RBX1 siRNA مشابهة لمستويات CENP-A الداخلية للخلايا المنقولة Luciferase siRNA ، مما يشير إلى أن CUL4A RBX1 E3 ligase مطلوب لتوطين CENP-A إلى السنتروميرات. تفقد طفرات الليسين CENP-A قدرتها على التوطين داخل السنتروميرات ، مما يشير إلى أن CENP-A K124 في كل مكان ضروري لتوطين CENP-A إلى السنتروميرات. الأهم من ذلك ، أن اندماج أحادي اليوبيكويتين الخارجي لبروتين CENP-A أنقذ تحالف CENP-A K124R ، مما أعاد البروتين إلى موقعه المركزي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إجراءات تثبيت الخلايا والتلوين المناعي في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تذكر أن تضع جميع المحاليل برفق على جوانب الآبار حتى لا يتم إزاحة الخلايا من أكواب الغطاء عند شطف العينات أو غمرها. لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد ساخن خارج غرفة جيدة التهوية أو أن المواد القابلة للاشتعال بالقرب من الحريق يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.