تطوير وتوصيف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير جهاز مائعيات دقيقة يتيح للخلايا البطانية النمو تحت تدفق قص ذي صلة فسيولوجياً، وقياس التغيرات التي يحفزها المادة المناهضة في إنتاجها من الكالسيوم وأكسيد النيتريك. يمكن أن تساهم هذه المنهجية في دفع مستقبل أبحاث الأوعية الدموية الدقيقة، من خلال التحقق من صحة نموذج الأوعية الدموية الدقيقة في المختبر وسد الفجوات بين الدراسات التي تُجرى في الجسم الحي والدراسات التي تُجرى في المختبر. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في التصميم المتنوع للقنوات الدقيقة لمحاكاة الأوعية الدموية المختلفة، وتحسين بيئة زراعة الخلايا لتكون أقرب إلى ظروف الجسم الحي مقارنة بالظروف الساكنة في المزارع الأصلية.

سيقوم سلي و شيانغ، وهما باحثان من مختبري، باستعراض الإجراءات. قبل البدء، استخدم تقنية الطباعة الضوئية القياسية لإنشاء قالب رئيسي، والطباعة الليثوغرافية الرخوة لتصنيع أجهزة القنوات الدقيقة المصنوعة من PDMS كما هو موضح في البروتوكول النصي. لتحضير أجهزة القنوات الدقيقة، قم أولاً بتغطية المدخل والمخرج بقطعة رقيقة من PDMS، ثم ضع الجهاز داخل طبق بتري يحتوي على منديل مبلل.

بعد ذلك، قم بتغطية الطبق بـ Parafilm وعقم الجهاز تحت ضوء UV لمدة ثلاث ساعات على الأقل. الخطوة التالية هي وضع الـ fibronectin. أولاً، ضع قطرة بحجم 30 إلى 50 µL من PBS عند المدخل.

قم بتطبيق تفريغ عند المخرج لشطف الجهاز. بعد ذلك، ضع قطرة من الفايبرونيكتين بتركيز 100 µg/mL عند المدخل. قم بتطبيق تفريغ عند المخرج لتحميل محلول الفايبرونيكتين.

بعد ذلك، قم بتغطية المدخل والمخرج. غلف الطبق بـ Parafilm مرة أخرى واحضن الجهاز طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اشطف الجهاز يدويًا باستخدام PBS ثلاث مرات.

بعد ذلك، قم بتعبئته بـ 30 إلى 50 µL من وسط زراعة الخلايا وقم بتدفئة الجهاز في حاضنة عند 37 °C لمدة 15 دقيقة على الأقل. ابدأ بخلط خلايا HUVECs في وسط زراعة HUVEC مع Dextran بنسبة 8% بتركيز يتراوح من 2 إلى 4 مليون خلية/mL. إن مادة Dextran ضرورية لزيادة اللزوجة وبالتالي تحسين عملية استزراع الخلايا.

بعد ذلك، ضع من 10 إلى 20 µL من الخلايا فوق المدخل وأدخلها باستخدام الجاذبية أو عن طريق الخاصية الشعرية باستخدام ماصة باستور زجاجية عند المخرج. بعد ذلك، قم بتحضين الجهاز لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة. ثم، تحقق من حالة استزراع الخلايا تحت المجهر.

إذا لزم الأمر، قم بتحميل المزيد من الخلايا للوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة. وبمجرد تحميل عدد كافٍ من الخلايا، اشطف الجهاز برفق باستخدام وسط زراعة خلايا عادي ودافئ لإزالة الديكستران (Dextran). بعد ذلك، قم بزراعة الخلايا في الجهاز دون أي تروية للأوساط لمدة ست ساعات.

بعد ذلك، قم بتجهيز توصيلات الأنابيب للتروية طويلة الأمد. ثبّت الجهاز على طبق بتري باستخدام شريط لاصق، ثم وصّل أنبوب المدخل بمحقنة مزودة بإبرة. أدخل الأنابيب في كل من مدخل ومخرج الجهاز.

قم بتوصيل أنبوب المخرج بمجمع نفايات. الآن، ضع الطبق وحاوية النفايات في حاضنة. قم بتوصيل المحقنة المزودة بأنبوب مدخل طويل بمضخة تروية خارجية تمر عبر باب الحاضنة.

بعد ذلك، يتم ضبط معدل التروية وفقاً للتصميم التجريبي. فمن خلال تروية محكومة بدقة، يمكن الحفاظ على المزرعة في شبكة الأوعية الدقيقة لمدة تصل إلى أسبوعين. وبناءً على ذلك، يمكن تمديد هذه العملية لإجراء دراسات طويلة المدى تحاكي البيئة الخلوية والديناميكية الدموية في مختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية.

لبدء عملية الصبغ المناعي، مثل وسم VE-cadherin، قم أولاً بتثبيت الخلايا عن طريق التروية باستخدام بارافورمالدهيد بنسبة 2% لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وبعد سلسلة من عمليات التروية للحجب والنفاذية والصبغ بالأجسام المضادة، احتفظ بالجهاز عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم تصوير الخلايا. ولتصوير تركيز الكالسيوم في الخلايا، قم بتروية الجهاز باستخدام 10 mg/mL من الألبومين في محلول رينجر لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C.

بعد ذلك، قم بتروية الجهاز بـ 5 µM من Fluo-4 AM لمدة 40 دقيقة عند 37 °C. ثم، اغسل Fluo-4 AM المرتبط بالتجويف باستخدام albumin Ringers لمدة 15 دقيقة عند 37 °C. بعد ذلك، قم بتشغيل نظام المجهر البؤري (confocal system) لتصوير مستويات الكالسيوم بين الخلايا باستخدام Fluo-4 AM. قم بالتقاط صور للأوعية الدموية الدقيقة المحملة بـ Fluo-4.

قم بجمع صور الخط الأساسي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتروية الجهاز باستمرار باستخدام 10 micromolar من ATP وسجل التغيرات في كثافة الفلورسنت لمدة 20 دقيقة. ولتصوير إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا، قم بتروية الجهاز بمحلول albumin Ringers لمدة 15 دقيقة عند 37 degrees Celsius.

بعد ذلك، قم بتروية الخلايا بـ 5 micromolar من DAF-2 DA لمدة تتراوح بين 35 إلى 40 دقيقة عند 37 degrees Celsius. بعد ذلك، قم بإعداد نظام التصوير الفلوري لقياس إنتاج أكسيد النيتريك المستحث بواسطة ATP. سجل خط الأساس لمدة 5 دقائق، ثم قم بتروية الجهاز بـ 10 micromolar من ATP والتقط الصور لمدة 30 دقيقة على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة.

بالنسبة لقياس أكسيد النيتريك في الخلية، من المهم إدراك أن محول الفصل الخاص بملف الشدة يمثل الإنتاج التراكمي لأكسيد النيتريك مع مرور الوقت وليس تركيز أكسيد النيتريك. قم بتحديد مناطق الاهتمام يدوياً من الصور التي تم جمعها على مستوى الخلية الفردية. تغطي كل منطقة اهتمام (ROI) مساحة خلية فردية واحدة يمكن تحديدها من خلال المخطط التفصيلي للفلورة.

قم بقياس التغيرات التي يحفزها ATP في مستويات الكالسيوم وأكسيد النيتريك في الخلايا البطانية، وذلك عن طريق حساب التغيرات في شدة وميض Fluo-4 بعد طرح خلفية النسيج. قم بقياس معدل إنتاج أكسيد النيتريك عن طريق إجراء تحويل تفاضلي أول لشدة وميض DAF-2 بمرور الوقت.

يحتوي نمط القناة الدقيقة في الجهاز على شبكة تفرعية مكونة من ثلاثة مستويات. وقد أُجريت محاكاة عددية ثلاثية الأبعاد لتقدير توزيعات إجهاد القص تحت معدل تدفق قدره 0.35 µL/min. كما تم استزراع الخلايا البطانية في الشبكة كما هو موضح.

بعد ذلك، تم وسم F-actin والنوى. وبالمثل، تم صبغ VE-cadherin أيضاً. كانت النتائج مشابهة للتعبير عن VE-cadherin في الوريد الصغير السليم.

بعد ذلك، تم فحص الزيادات التي يحفزها ATP في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا وإنتاج أكسيد النيتريك. تم فحص مستويات الكالسيوم باستخدام Fluo-4 AM كما هو موضح في قسم البروتوكول. كما تمت مراقبة إنتاج أكسيد النيتريك باستخدام DAF-2 DA كما هو موضح في قسم البروتوكول.

كانت النتائج قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام وريدات سليمة تم ترويتها بشكل فردي. كان التقدم سهلاً ومحكوماً بدقة في الظروف البيولوجية وبيئات السوائل الديناميكية، وهو أمر لم يكن ممكناً باستخدام تقنيات المهارات المجهرية التقليدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الجهاز، وإجراء قياسات الكالسيوم وأكسيد النيتريك.

بعد أن مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين، ليس فقط لاستقصاء الآليات الكامنة التي يحفزها المناهض، بل وأيضاً لفتح تطبيقات أوسع في مجال الأبحاث الطبية الحيوية.