تطوير وتوصيف في المختبر شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا ²⁺] _ط والنيتريك إنتاج أكسيد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير جهاز ميكروفيليديك يسمح للخلايا البطانية بالنمو تحت تدفق القص ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية وقياس التغيرات التي يسببها ناهض في إنتاج الكالسيوم وأكسيد النيتريك. يمكن أن تساعد هذه الرسالة في النهوض بمستقبل أبحاث الأوعية الدقيقة ، من خلال التحقق من صحة نموذج الأوعية الدقيقة في المختبر وسد الفجوات بين الدراسات في الجسم الحي والدراسات في المختبر. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في التصميم متعدد الاستخدامات للقنوات الدقيقة لتقليد الأوعية الدموية المختلفة ، كما أنها تعمل على تحسين بيئة زراعة الخلايا الأقرب إلى الجسم الحي من الكهرباء الساكنة الشرطية لتلك الثقافات الأصلية.

سيظهر الإجراءات سولي وشيانغ ، الاثنان من مختبري. قبل البدء ، استخدم الطباعة الحجرية الضوئية القياسية لإنشاء قالب رئيسي وطباعة حجرية ناعمة لتصنيع أجهزة القنوات الدقيقة PDMS كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير أجهزة القنوات الدقيقة ، قم أولا بتغطية المدخل والمخرج بقطعة رقيقة من PDMS وضع الجهاز داخل طبق بتري بمنديل مبلل.

ثم لف الطبق ببارافيلم وقم بتعقيم الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث ساعات على الأقل. الخطوة التالية هي تطبيق الفيبرونكتين. أولا ، ضع قطرة من 30 إلى 50 ميكرولترا من PBS عند المدخل.

قم بإنشاء مكنسة كهربائية في المخرج لشطف الجهاز. بعد ذلك ، ضع قطرة 100 ميكروغرام لكل مليلتر فيبرونيكتين عند المدخل. قم بإنشاء فراغ عند المخرج لتحميل محلول الفبرونيكتين.

بعد ذلك ، قم بتغطية المدخل والمخرج. لف الطبق بالبارافيلم مرة أخرى واحتضن الجهاز طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف الجهاز يدويا باستخدام PBS ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بتحميله ب 30 إلى 50 ميكرولترا من وسائط زراعة الخلايا وقم بتسخين الجهاز في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. ابدأ بخلط HUVECs في وسائط ثقافة HUVEC مع ثمانية بالمائة من ديكستران بنسبة اثنين إلى أربعة ملايين خلية لكل ملليلتر. هناك حاجة إلى ديكستران لزيادة اللزوجة وبالتالي تحسين بذر الخلايا.

بعد ذلك ، ضع 10 إلى 20 ميكرولترا من الخلايا فوق المدخل وأدخلها باستخدام الجاذبية أو باستخدام عمل شعري من ماصة باستور زجاجية عند المخرج. بعد ذلك ، احتضان الجهاز لمدة 15 إلى 20 دقيقة. ثم تحقق من حالة البذر تحت المجهر.

إذا لزم الأمر ، قم بتحميل المزيد من الخلايا لتحقيق كثافة الخلية المطلوبة. بمجرد تحميل عدد كاف من الخلايا ، اشطف الجهاز برفق بوسط زراعة الخلايا العادي والدافئ لإزالة ديكستران. ثم قم بزراعة الجهاز دون أي تروية للوسائط لمدة ست ساعات.

بعد ذلك ، قم بإعداد وصلات الأنابيب للتروية على المدى الطويل. قم بلصق الجهاز على طبق بتري ثم قم بتوصيل أنبوب المدخل بحقنة بإبرة. أدخل الأنبوب في كل من مدخل ومخرج الجهاز.

قم بتوصيل أنبوب المخرج بمجمع النفايات. الآن ، ضع الطبق وحاوية النفايات في حاضنة. قم بتوصيل المحقنة بأنبوب مدخل طويل بمضخة تروية خارجية تمر عبر باب الحاضنة.

ثم اضبط معدل التروية وفقا للتصميم التجريبي. مع التروية التي يتم التحكم فيها جيدا ، يمكن الحفاظ على الثقافة في شبكة الأوعية الدقيقة لمدة تصل إلى أسبوعين. لذلك ، يمكن تمديده ليشمل دراسات طويلة المدى تحاكي البيئة الخلوية والديناميكية الدموية على الحالة الفسيولوجية والمرضية المختلفة.

لبدء التلوين المناعي ، مثل وضع العلامات على VE-cadherin ، قم أولا بإصلاح الخلايا عن طريق الترشيح بنسبة اثنين بالمائة من بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد سلسلة من التروية لمنع الأجسام المضادة ونفاذها وصخبها ، احتفظ بالجهاز عند أربع درجات مئوية حتى يتم تصوير الخلايا. لتصوير تركيز الكالسيوم في الخلايا ، قم بدمج الجهاز ب 10 ملليغرام لكل مليلتر من الألبومين في محلول Ringer لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بدمج الجهاز بخمسة ميكرومولار Fluo-4 AM لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل التجويف المرتبط Fluo-4 AM مع الألبومين Ringers لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، ابدأ تشغيل النظام متحد البؤر للتصوير بين الخلايا لمستوى الكالسيوم باستخدام Fluo-4 AM. احصل على صور للسفن الصغيرة المحملة ب Fluo-4.

اجمع الصور الأساسية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بدمج الجهاز بشكل مستمر باستخدام 10 ميكرومولار ATP وسجل التغيرات في شدة التألق لمدة 20 دقيقة. لتصوير إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا ، قم ببث الجهاز بألبومين Ringers لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بدمج الخلايا ب 5 ميكرومولار DAF-2 DA لمدة 35 إلى 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد نظام التصوير الفلوري لقياس إنتاج أكسيد النيتريك الناجم عن ATP. سجل خط الأساس لمدة 5 دقائق ، ثم قم بدمج الجهاز ب 10 micromolar ATP واجمع الصور لمدة 30 دقيقة على فترات دقيقة واحدة.

لقياس أكسيد النيتريك الخلية ، من المهم أن نفهم أن محول الفصل لملف تعريف الشدة يمثل إنتاجا تراكميا لأكسيد النيتريك بمرور الوقت وليس تركيزا لأكسيد النيتريك. حدد منطقة الاهتمام يدويا من الصور التي تم جمعها على مستوى الخلية الفردية. يغطي كل عائد استثمار مساحة خلية فرد واحد والتي يمكن الإشارة إليها من خلال مخطط فلوريسنس.

تحديد التغيرات الناجمة عن ATP في الكالسيوم البطاني وأكسيد النيتريك. من خلال حساب التغيرات في شدة floresense ل Fluo-4 ، أقل من خلفية الأنسجة. حدد معدل إنتاج أكسيد النيتروز عن طريق إجراء التحويل التفاضلي الأول لشدة فلوريسنس ل DAF-2 بمرور الوقت.

يحتوي نمط القناة الدقيقة في الجهاز على شبكة متفرعة ثلاثية المستويات. تم إجراء محاكاة عددية ثلاثية الأبعاد لتقدير توزيعات إجهاد القص تحت معدل تدفق 0.35 ميكرولتر في الدقيقة. كانت الخلايا البطانية تزرع في الشبكة كما هو موضح.

ثم تم تصنيف F-actin والنوى. وبالمثل ، تم تلطيخ VE-cadherin أيضا. كانت النتائج مشابهة لتعبير VE-cadherin في وريد سليم.

بعد ذلك ، تم فحص الزيادات الناجمة عن ATP في إنتاج الكالسيوم وأكسيد النيتريك داخل الخلايا. تم فحص مستويات الكالسيوم باستخدام Fluo-4 AM كما هو موضح في قسم البروتوكول. تم رصد إنتاج أكسيد النيتريك باستخدام DAF-2 DA كما هو موضح في قسم البروتوكول.

كانت النتائج قابلة للمقارنة مع تلك المستمدة من الأوردة السليمة المنفوخة بشكل فردي. كان المتقدم سهلا ويتم التحكم فيه بإحكام في الظروف البيولوجية وبيئات السوائل الديناميكية ، والتي لم تكن ممكنة باستخدام تقنيات المهارات الدقيقة التقليدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الجهاز ، وإجراء قياسات الكالسيوم وأكسيد النيتريك.

بعد هذه التقنية مهدت الطريق للباحثين ، ليس فقط للتحقيق في ناهض أساسي ناتج ولكن أيضا لفتح تطبيقات أوسع للبحوث الطبية الحيوية.