Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

الهدف العام من تقنية الحقن المجهري هذه هو توليد أسماك معدلة وراثيا ومعدلة الجينوم لاختبار وظيفة الجينات والمحسن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الوراثة التنموي والتطوري مثل كيفية عمل الجينات والمعززات لتوليد نمط الجسم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تولد أسماكا معدلة وراثيا بكفاءة للتحليل الجيني الوظيفي.

بعد تحضير اثنين من البلازميدات و mRNA وفقا لبروتوكول النص ، اسحب ما لا يقل عن أربع إبر ماصة دقيقة من زجاج البورسيليكات. تخزينها عموديا في وعاء تخزين شعري بحيث تكون الأطراف الحادة متجهة لأسفل. لتخصيب ما يصل إلى مائة بيضة لاصقة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول المنوية واستخدم طرف الماصة للتقليب برفق لضمان تخصيب جميع البويضات.

أثناء العمل على الثلج ، قم بملء ثلاث إبر على الأقل عن طريق سحب 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن في الطرف الحاد للإبرة والسماح لها بالتصريف. في غضون ذلك ، قم بتشغيل ضوء الإضاءة الانتقالية لمجهر التشريح وضع صفيحة زجاجية مساحتها 13 سم مربع على قاعدة ضوء المجهر مع شفرة منشار جصيص مقاس 15 سم أعلى اللوح الزجاجي. قم بتوجيه المنشار بشكل عمودي على جهاز الحقن بحيث تكون المسافات البادئة متجهة نحو حامل الإبرة ثم قم بتشغيل صندوق التحكم وتأكد من ضبط الضغط على حوالي 175 كيلو باسكال.

اضبط مدة الحقن على 180 مللي ثانية. بعد ذلك ، قم بفك حامل الإبرة ، ثم أدخل إبرة مملوءة في الحامل حتى يمكن الشعور بمقاومة الحامل المطاطي وشد حامل الإبرة حتى يصبح إحكام الإصبع. ثم اضبط زاوية الإبرة على 45 درجة تقريبا.

استخدم عناصر التحكم في أداة المعالجة الدقيقة لضبط الإبرة بحيث تكون النهاية في منتصف مجال الرؤية. قم بتكبير التكبير بمقدار 40 ضعفا تقريبا وركز على طرف الإبرة ، والذي يجب ألا يلمس الزجاج أدناه. باستخدام ملقط صانع الساعات، أمسك طرف الإبرة بعرض ملقطين إلى ثلاثة من النهاية وكسر الطرف برفق بزاوية 60 درجة.

ثم اضغط على دواسة قدم الحقن عدة مرات لاختبار ما إذا كانت الإبرة مكسورة أم لا. بعد بضع نقرات ، يجب أن تبدأ القطرات الحمراء الصغيرة في الخروج من النهاية. استخدم ماصة نقل يمكن التخلص منها لوضع بضع قطرات من ماء stickleback على اللوح الزجاجي.

اخفض الإبرة برفق في الماء ، ثم قم بزيادة الضغط الخلفي حتى يخرج تيار خافت من السائل الوردي من الإبرة. اسحب الإبرة قدر الإمكان حتى لا تتلف أثناء تحضير الأجنة. بعد حوالي 25 دقيقة من الإخصاب ، استخدم طرفي ماصة سعة 10 ميكرولتر لإزالة خمسة إلى 10 أجنة من القابض ونقلها إلى الصفيحة الزجاجية.

باستخدام أطراف الماصة ، افصل الأجنة برفق إلى فجوات فردية لشفرة المنشار مع توخي الحذر وليس ثقب الأجنة. بعد ذلك باستخدام ماصة النقل ، أضف كمية كافية من الماء اللاصق لتغطية الأجنة. ثم بعد ثلاث إلى خمس ثوان ، قم بإزالة معظم الماء مع ترك حجم صغير فقط يغطي كل جنين.

بدءا من الجنين الأبعد ، حرك اللوحة الزجاجية وقم بتكبير الجنين بحيث يملأ ما يقرب من 25 بالمائة من مجال الرؤية. اخفض الإبرة في مجال الرؤية ، ثم استخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر لتدوير الجنين برفق لتحديد النتوء المبلاستوميري ، وهو نتوء محبب ، أصفر قليلا ، مرتفع من السيتوبلازم في الجزء العلوي من الصفار. قم بتدوير الجنين بحيث يكون الأريمة عموديا مباشرة على نهاية الإبرة.

اخفض الإبرة مع الضغط ببطء وبشكل متساو لثقب الكوريون وإدخال الإبرة في السيتوبلازم دون دفعها عبر صفار البيض الأساسي. اضغط على دواسة القدم ثلاث إلى أربع مرات للحقن بحيث تملأ بلعة حمراء ذات حواف منتشرة قليلا حوالي 1/8 قطر السيتوبلازم. إن وجود إبرة حادة عمودية على الكوريون سيسهل هذه الخطوة.

سيساعد الحد من كمية الماء المضافة في الحفاظ على نعومة الكوريون. وأخيرا ، سيؤدي استهداف السيتوبلازم إلى زيادة احتمالية الحصول على معدل وراثيا. استخدم أدوات التحكم في أداة المعالجة الدقيقة لسحب الإبرة ، وباستخدام طرف الماصة سعة 10 ميكرولتر ، اضغط باستمرار على الجنين إذا التصق بالإبرة.

بعد سحب الإبرة ، حرك اللوح الزجاجي لمحاذاة الجنين التالي مع الإبرة وكرر الحقن. عندما يتم حقن جميع الأجنة ، استخدم ماصة النقل مع قطع النهاية لإضافة الماء إلى اللوحة. ثم استخدم ماصة النقل لجمع الأجنة ووضعها في طبق بتري 150 ملم مملوء بماء stickleback.

احتضان الأجنة عند 18 درجة مئوية. بعد يوم واحد من الحقن ، اسكب الماء برفق واستبدله بالماء العذب. تحقق من وجود أجنة ميتة أو مشوهة وقم بإزالتها لمنع التلوث.

كما هو موضح هنا ، بالنسبة للجينات المعدلة وراثيا التي لها نشاط محسن ، ينتج عن الحقن الناجح تعبير خلوي محدد للجين المعدل. على سبيل المثال ، في الزعانف الصدرية والمتوسطة والحبل الظهري. يمكن بعد ذلك تهجين الأسماك المحقونة لإنتاج خطوط مستقرة مثل هذا الخط الخلفي المستقر الذي يدفع تعبير GFP في القلب الجنيني بعد أربعة أيام من الإخصاب.

بالنسبة للمحسن النشط ، ستظهر 40 إلى 50 في المائة من الأجنة تعبيرا جينيا معدلا للأنسجة ، على سبيل المثال ، في الزعانف المتوسطة والصدرية. ما يصل إلى 100 في المائة من أسماك F0 إيجابية GFP تعبر عن حصيلة اثنين من الجينات المعدلة وراثيا البلازميد تنتج ذرية معدلة وراثيا. ومع ذلك ، فإن النسبة المئوية للنسل الذي يحمل الجين المعدل تختلف بشكل كبير من أقل من واحد في المائة إلى 72 في المائة.

إن حفظ الأجنة المحقونة الإيجابية ل GFP فقط يزيد بشكل عام من كفاءة الإرسال. يظهر ما يصل إلى 10 في المائة فقط من أجنة F0 المحقونة مرة أخرى مضان في الأنسجة المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معدل انتقال الظهر أقل من معدل انتقال البلازميد.

مع ما يصل إلى 14 في المائة فقط من sticklebacks التي تم فحصها تنقل الظهر. على عكس الكفاءة المنخفضة للانتقال الخلفي ، فإن 70 إلى 100 في المائة من الأسماك المحقونة بالمخالب لها آفات فسيفسائية. هنا يشير أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المقطوع في كل من الأجنة المحقونة إلى أن بعض الخلايا في كل جنين تحمل آفات في الموضع المستهدف.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ما يزيد قليلا عن ساعة لقابض من 100 جنين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الممارسة والصبر مطلوبان لتحسين التقنية وبقاء الجنين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر للإجابة على مزيد من الأسئلة حول الأنماط التفصيلية للتعبير المحسن.

أيضا ، يمكن زراعة الأسماك المعدلة الجينوم بشكل متقاطع لدراسة الأنماط الظاهرية الناتجة عن الطفرات المستحثة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة التطوري والتنموي لدراسة تنظيم الجينات ووظيفتها في sticklebacks. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن أجنة stickleback لتحرير الجين والجينوم.