تقنيات لتطور قوية خميرة تخمر البنتوز للالتحويل البيولوجي من مادة الخشب إلى إيثانول

الهدف العام من إجراء التطور التكيفي هذا هو اشتقاق سلالات قوية من الخميرة الأصلية المخمرة للزيلوز scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 التي يمكنها تخمير سكريات السداسية والبنتوز بسرعة أكبر في التحلل المائي غير المؤكسد إلى الإيثانول القابل للاسترداد اقتصاديا. تنقل هذه الطريقة اللجنوسليلوز إلى صناعة الإيثانول إلى الأمام من خلال توفير خارطة طريق للسلالات ذات التعديلات المعقدة ، مما يسمح بتخمير السكريات في التحلل المائي الذي يحتوي على مثبطات ميكروبية. هنا ، تتمثل الميزة الرئيسية للتطور المستهدف في أن السلالات القوية مصبوبة من خميرة أصلية قادرة على تخمير الزيلوز ، مما يلغي الحاجة إلى هندسة سلالات السكريات الصناعية.

أدركنا أنه من غير المرجح أن تكون أي سلالة خميرة واحدة قوية في أنواع مختلفة من التحلل المائي ، مثل أفكس معالجة الذرة المعالجة مسبقا أو عشب التبديل المعالج مسبقا بالحمض المخفف. إن قدرة scheffersomyces stipitis على الخضوع لدورة تكاثر جنسية مفيدة لمزيد من الاستغلال في العمل الحالي لأن السلالات المختلفة التي تم تطويرها يمكن دمجها في سلالة واحدة أكثر قوة من خلال تزاوج السلالات التي لها هذه السمات المختلفة. سيوضح الإجراء المؤلفان المشاركان ستيفاني طومسون ومورين شيا أندرش وهما فنيران في العلوم البيولوجية في مختبري.

قبل البدء في إجراء التخصيب هذا ، قم بإعداد استزراع مسبق للسلالة NRRL Y-7124 في قارورة سعة 125 مليلتر وسلسلة تخفيف من إنزيم تمدد ألياف الأمونيا السكرية المعالجة مسبقا ، أو AFEX CSH. استخدم ماصة متكررة لملء صفيحة دقيقة سعة 96 بئرا بسعة 15 ميكرولتر لكل بئر، وثمانية آبار لكل تخفيف للتحلل المائي. قم بالتلقيح ببضعة ميكرولترات من الزراعة المسبقة لكل بئر للسماح بامتصاص أولي عند 620 نانومتر ، أو A620 أكبر من أو يساوي 0.1.

ضع الصفيحة الدقيقة في صندوق بلاستيكي بمنشفة ورقية مبللة للرطوبة واحتضانها بشكل ثابت لمدة 24 إلى 28 ساعة عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقراءة الصفيحة الدقيقة لتحديد الثقافات التي نمت ماديا إلى A620 أكبر من 1.0 في التخفيف المائي الأكثر تركيزا. تجمع الآبار المحددة في أنبوب ميكرو فوج ، ووزعها على لوحة تعبئة.

انقل من واحد إلى خمسة ميكرولتر من لوحة التعبئة إلى كل بئر من سلسلة التخفيف المائية الجديدة لتحقيق A620 أولي أكبر من أو يساوي 0.1 واحتضان اللوحة كما كان من قبل. راقب نمو الثقافات في الصفيحة الدقيقة باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقراءة الصفيحة الدقيقة. تحضير مخزون الجلسرين من مزارع التكيف بانتظام.

تجمع أربعة آبار من أكبر تركيز للتحلل المائي في ملف التبريد ، واخلط واحدا إلى واحد مع 20٪ من الجلسرين المعقم. تجميد الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. كرر إجراء التخصيب هذا حتى يظهر النمو في 12٪ جلوكان AFEX CSH باستمرار في 24 ساعة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتجميع مخزونات الجلسرين المختارة من مزارع التكيف مع خميرة الشعير ، أو سكر العنب ، أو YM agar. ثم بعد النمو ، استخدم الخطوط لتلقيح 50 ميكرولترا من 3٪ أو 6٪ جلوكان AFEX CSH في كل من الآبار الدقيقة الثلاثة. احتضان الصفيحة الدقيقة لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية.

تجمع الآبار المستعمرة بأعلى قوة للتحلل المائي مع نمو قوي. ولوحة التخفيف إلى YM أو 6٪ جلوكان AFEX CSH أجار. احتضن الألواح في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة.

اختر خمس مستعمرات مفردة من أعلى صفيحة تخفيف تظهر نموا للتجميد كمزارع مخزون الجلسرين. خط كل مستعمرة إلى لوحة YM واحتضنها لمدة 24 ساعة. باستخدام حلقة معقمة ، انقل سلسلة متطورة من الخلايا إلى حجم صغير من الجلسرين بنسبة 10٪ ممزوجة لتعليق الخلايا وتوزيعها على ملفين إلى ثلاثة ملفات تبريد للتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لاختبار العزلات في مزارع دفعة 6٪ جلوكان AFEX CSH ، قم بنقل الخلايا من لوحات 48 ساعة مخططة من مخزون الجلسرين إلى محلول فوسفات البوتاسيوم الأس الهيدروجيني 7 لتحضير معلقات الخلية. بعد قياس الكثافة البصرية لكل تعليق خلية ، اضبط مستوى الصوت باستخدام مخزن مؤقت إضافي للوصول إلى A620 من عشرة. استخدم ميكرولتر واحد من كل معلق لتلقيح كل من الآبار الأربعة سعة 50 ميكرولترا من التحلل المائي للجلوكان بنسبة 3٪ إلى A620 الأولي 0.2.

احتضان الصفيحة الدقيقة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بنقل بئرين من الصفيحة الدقيقة لمدة 24 ساعة لتلقيح 25 ملليلتر من 6٪ جلوكان AFEX CSH عند درجة الحموضة 5. أغلق القوارير بإسفنجة السيليكون واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.

استخدم 6٪ جلوكان AFEX CSH الثقافات المسبقة لتلقيح ثقافات نمو مماثلة 25 ملليلتر في نسختين إلى A620 الأولي 0.1. احتضان مزارع النمو لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. لاختبار نقص الديوكسين في العزلات في مزارع الدفعات ذات الوسط المحدد الأمثل ، أو ODM ، مع السكريات المختلطة ، قم بتلقيح المزارع المسبقة من 75 مل ODM مع 150 جراما لكل لتر من الزيلوز في قوارير سعة 125 ملليلتر مع إغلاق إسفنجي سيليكون.

احتضان لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. استخدم المزارع المسبقة لتلقيح A620 من 0.1 مزارع اختبار مكررة مماثلة 75 مليلتر مع ODM تحتوي على 75 جراما لكل لتر من الجلوكوز و 75 جراما لكل لتر من الزيلوز عند درجة الحموضة 6.5. رج القوارير عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.

قبل 24 ساعة من تلقيح ثقافة مستمرة ، قم بإعداد استزراع مسبق لمستعمرة تمثيلية تتحمل AFEX CSH في ODM الخالية من الإيثانول في قارورة سعة 125 ملليلتر. استخدم خمسة إلى 10 ملليلتر من الزراعة المسبقة المعزولة التي تتحمل AFEX CSH لتلقيح 100 مل من ODM في قارورة دوارة مغلفة سعة 100 مل للحصول على A620 أولي من 0.5. حافظ على حجم المزرعة عند 25 درجة مئوية.

حركه بسرعة 200 دورة في الدقيقة وقم بتجهيزه بقطب كهربي قابل للتعقيم ، وجهاز تحكم في الأس الهيدروجيني ، وحمام مائي دائري يتم التحكم في درجة حرارته. في البداية ، نظرا لأن نمو الخلية سيكون بطيئا بسبب التعرض للإيثانول ، فقم بإعداد مضخة تعمل بدرجة الحموضة بحيث عندما يقلل تخمير الثقافة من الرقم الهيدروجيني إلى 5.4 ، ستغذي المضخة درجة الحموضة 6.3 ODM مع 100 جرام لكل لتر من الزيلوز و 50 جراما لكل لتر من الإيثانول لوقف المزيد من انخفاض الأس الهيدروجيني. حافظ على الحجم عند 100 مل باستخدام مضخة النفايات السائلة التي تقوم بقشط سطح المزرعة باستمرار.

قم بقياس حجم النفايات السائلة التي تم جمعها واسحب عينات من المزارع المستمرة كل 48 إلى 72 ساعة لتحليل تركيز الخلايا القابلة للحياة والمنتجات والركائز كما هو موضح في المخطوطة. حفظ مخزون الجلسرين بانتظام عن طريق عزل المستعمرات عن لوحات البقاء لتخفيفات العينات المخزنة التي تشكل 30 إلى 100 مستعمرة ، تمثل المستعمرات القوية الأكثر انتشارا في ذلك الوقت في التخصيب. غمر الألواح بخمسة ملليلتر من 10٪ من الجلسرين للسماح بإعداد ملفات التبريد المكررة.

إذا كان بإمكان المزارع أن تنمو بشكل مطرد بمعدلات محددة تزيد عن 0.01 في الساعة على الزيلوز في وجود أكثر من 25 جراما لكل لتر من الإيثانول ، فابدأ تغذية المزرعة المستمرة بمعدل تخفيف منخفض يبلغ حوالي 0.01 في الساعة إلى حجم الاحتفاظ 100 ملليلتر. بمرور الوقت ، ارفع الإيثانول الموجود في العلف نحو 50 جراما لكل لتر. يعد التشعيع فوق البنفسجي لللقاح لإعادة تشغيل الثقافات المستمرة خيارا لتسريع معدل الطفرة.

التقاط السكان المتقدمين في مخزون الجلسرين. قبل عزل مستعمرات الخلية المفردة ، يتم تحديد مجموعات مخزون الجلسرين مع تخمير زيلوز محسن في وجود الإيثانول ، كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم هذه المجموعات المتفوقة لخطوط اللوحات.

تستخدم الألواح المخططة لإعداد معلقات خلية مخزنة كثيفة من A620 تساوي خمسة. ثم يتم استخدام معلقات الخلايا لتلقيح المزارع المسبقة في 96 لوحة بئر عميقة. احتضان لمدة 48 ساعة عند 25 درجة مئوية و 400 دورة في الدقيقة ومدار بوصة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإثراء المستعمرات المتسامحة باستخدام كل زراعة مسبقة لتلقيح 16 مليلتر واحد من الثقافات المكررة إلى A620 أولي من 0.5 في سائل تحلل العشب المعالج مسبقا بالحمض ، مختلط واحد إلى واحد مع ODM بالإضافة إلى 50 جراما لكل لتر من الزيلوز ، وما يكفي من الإيثانول لتوفير 20 أو 30 أو 40 جراما لكل لتر من تحدي الإيثانول. احتضان لمدة 48 ساعة عند 25 درجة مئوية و 400 دورة في الدقيقة ومدار بوصة واحدة. لكل مخزون مختلف من الجلسرين ، قم بحصاد آبار الاستزراع بأعلى تركيز من الإيثانول مما يسمح بالنمو واستخدام الزيلوز.

قم بلوحة كل خط خلية إلى YM agar للحصول على مستعمرات مفردة سائدة للحفاظ عليها في الجلسرين. اختر 10 مستعمرات لكل خط خلية وخط كل منها إلى لوحة أجار YM لتحضير مخزون الجلسرين. بعد التكيف مع AFEX CSH ، تكشف مقارنة أداء التخمير في ODM بين السلالة الأم والمجموعات السكانية المتكيفة أن المجموعات السكانية المتكيفة تستخدم الزيلوز بشكل أكثر كفاءة لصنع الإيثانول بسرعة أكبر وبكميات أعلى.

تم تطوير مستعمرة متحملة للتحلل المائي لتحسين تحمل الإيثانول عن طريق الاختيار المستمر للثقافة على ODM الذي يحتوي على الزيلوز ومستويات عالية من الإيثانول. تجاوزت جميع المجموعات السكانية المتكيفة الوالد في القدرة على تحفيز استقلاب الزيلوز في وجود 40 جراما لكل لتر من الإيثانول. تلخص هذه الرسوم البيانية أداء العزلات فائقة التحمل التي تم تقييمها من حيث معدلات امتصاص الزيلوز وإنتاجية الإيثانول بالنسبة إلى السلالة الأصلية لكل تركيبة من PSGHL.

تم فحص أفضل السلالات المختارة من الشاشة الأولية على PSGHL الغني بالزيلوز لاحقا على ثلاثة تحلل مائي كامل وتم حساب مؤشر الأداء النسبي ، أو RPI ، لتخمير كل عزلة داخل كل تحلل مائي. بعد ذلك ، تم حساب مؤشرات الأداء العام المجمعة لكل عزلة. خمس عزلات ، ثلاثة و 14 و 27 و 28 و 33 ، كان لها مؤشر أسعار الرشد الإجمالي أعلى من 60 ، مما صنفها على أنها الأكثر قوة لجميع الاختلافات في التحلل المائي وظروف المغذيات مجتمعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية تحدي خميرة تخمير الزيلوز مثل scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 في عملية تطور مستهدفة ، وإثراء وعزل وتقييم المشتقات الأكثر قوة التي تخمر السكريات المختلطة بشكل أكثر فعالية في المحلل المائي غير المؤكسد. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية باستثمار يومي للوقت يبلغ متوسطه حوالي ساعة في اليوم. يمكن توثيق التغييرات المهمة في عملية التطور في أقل من أربعة أشهر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إنقاذ السكان المتقدمين بانتظام عن طريق تحضير مخزون الجلسرين للتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. وهذا يسمح بتعافي السكان أو التقييم الدوري أو العزل أو إعادة بدء عملية التطور. لإدارة الطفرات المختلفة ، تذكر فحص الخميرة بانتظام في ظل ظروف خاصة بالعملية لمجموعة من الأنماط الظاهرية.

حساب مؤشرات الأداء النسبي الإجمالية عديمة الأبعاد ، أو RPIs ، بناء على المعلمات الحركية ، بتقييم رتبة السلالة والمتانة للاختلافات في ظروف التخمير مثل نوع التحلل المائي ومكملات المغذيات. الخمائر المتفوقة الناشئة عن كل مرحلة من مراحل عملية التطور هي مرشحة لتسلسل الجينوم بحيث يتم تقليل طبيعة التحسينات مثل تحمل المثبطات ويمكن فهم التأخر ثنائي الأكسجين واستخدامه لتصميم سلالات التحفيز الحيوي من الجيل التالي.