الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف طريقة يمكن استخدامها لدراسة تكوين طبقة ثنائية الدهون الآلي باستخدام غشاء رقيق بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المستشعر الحيوي النانوي فيما يتعلق بتفاعلات الغشاء والبروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تكوين الطبقة الدهنية الثنائية مؤتمتة وقابلة للتكرار.

للبدء ، قم بإعداد المحلول العازل عن طريق الجمع بين كلوريد البوتاسيوم وهيدروكلوريد تريس و EDTA في الماء المقطر. ثم اضبط درجة الحموضة للمحلول على 8.0. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح 0.2 ميكرون ، وقم بتعقيم المحلول عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الدهون للطلاء المسبق عن طريق إذابة 3٪ من الدهون في خليط يتكون من جزأين غير عادي وثمانية أجزاء من سداسي ديكان من حيث الحجم. حرك المحلول طوال الليل باستخدام دوار. أيضا ، قم بإعداد محلول الدهون لتكوين الغشاء عن طريق إذابة 0.1٪ من الدهون في نفس الخليط من جزأين undecane وثمانية أجزاء من hexadecane من حيث الحجم.

قلب هذا المحلول طوال الليل على جهاز دوار أيضا. من أجل تحضير غشاء رقيق PDMS ، امزج تسعة أجزاء من البوليمر المسبق مع جزء واحد من عامل المعالجة في كوب الخلط. ضع خمسة جرامات من هذا الخليط في طبق بتري ، وقم بتدوير الطبق عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لتشكيل فيلم بسمك 200 إلى 250 ميكرون.

بعد ذلك ، ضع طبق بتري في مجفف فراغ واسحب مكنسة كهربائية من 100 مللي تور لمدة ساعتين لإزالة فقاعات الهواء المتبقية. ثم اخبزي الفيلم الرقيق في فرن لمدة خمس ساعات عند 70 درجة مئوية لبلمرة PDMS. بمجرد أن يبرد ، قم بتقطيع الطبقة الرقيقة المبلمرة إلى سنتيمترين مربعين في سنتيمترين مربعين ، واستخدم ثقب قطره 500 ميكرون لعمل فتحة صغيرة في وسط المربع.

بعد ذلك ، استخدم ماصة دقيقة لطلاء الفتحات مسبقا بميكرولتر واحد من محلول الدهون بنسبة 3٪. لإنشاء غرفة غشاء الدهون السوداء ، قم بتصميم كتلتين متماثلتين للغرفة باستخدام برنامج الرسم ثلاثي الأبعاد. بعد ذلك ، قم بتصنيع الغرفة باستخدام كتلة من PTFE وآلة CNC.

لتجميع الغرفة ، ضع الفيلم الرقيق PDMS المطلي مسبقا بين كتلتي PTFE ، بحيث تتمركز الفتحة الموجودة على الأغشية الرقيقة PDMS مع الفتحة الموجودة في الغرفة. استخدم زجاج الغطاء والشحم المفرغ لإغلاق الحواف الخارجية للغرفة. بمجرد إغلاقها ، قم بتثبيت الغرفة المجمعة باستخدام الصواميل والبراغي.

من المهم التأكد من إغلاق الغرفة جيدا حتى لا يكون هناك تسرب للسائل. باستخدام ماصة، قم بإيداع 0.5 ميكرولتر من محلول الدهون بنسبة 0.1٪ على فتحة الأغشية الرقيقة PDMS، المجمعة مع الغرفة. ثم ضع الغرفة في بيئة مبردة أقل من 10 درجات مئوية وقم بتخزينها حتى الحاجة إليها.

لتشكيل غشاء دهني أسود مع تجميع ذاتي سريع ، اسحب الغرفة من الثلاجة وأضف ملليلترين من محلول المخزن المؤقت في كل جانب من جوانب الغرفة. اترك الغرفة جانبا لمدة 10 دقائق حتى تذوب سلائف الغشاء المجمدة. بعد ذلك ، ضع الغرفة على مناور دقيق للتحكم بدقة في الارتفاع فيما يتعلق بمصدر الضوء والمجهر.

باستخدام مصباح الألياف البصرية الهالوجين ، قم بإضاءة جانب واحد من الغرفة لتفتيح فتحة الفيلم الرقيق PDMS. على الجانب الآخر ، ضع هدفا بمعدل 20 ضعفا بما يتماشى مع الفتحة وراقب المركز حيث يصبح اللون أكثر إشراقا من الحلقة. للقياس الكهربائي ، قم بإعداد أقطاب كلوريد الفضة عن طريق وضع سلك فضي بسمك 208 ميكرومتر في محلول هيبوكلوريت الصوديوم لمدة دقيقة واحدة على الأقل.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمضخم قطب كهربائي صغير. بعد ذلك ، ضع أقطاب كلوريد الفضة في كل جانب من جوانب الغرفة ، بحيث تكون في المحلول العازل. باستخدام برنامج الفيزيولوجيا الكهربية ، قم بتطبيق شكل موجة مثلثة 10 مللي فولت عبر الغشاء للحصول على موجة مربعة.

سجل الخصائص الكهربائية للغشاء بالنقر فوق زر التسجيل. استمر في التسجيل حتى يتم ملاحظة موجة مربعة موحدة. ثم قم بإنهاء التسجيل بالنقر فوق أيقونة المربع الأسود.

يمكن استخدام طريقتين لدمج جراميسيدين أ في الطبقة الدهنية الثنائية. أولا ، يمكن إضافة غراميسيدين أ مباشرة إلى محلول الدهون قبل نشر محلول الدهون على فتحة الطبقة الرقيقة PDMS. ثانيا ، يمكن إضافة محلول جراميسيدين أ إلى الغرفة عندما تتشكل طبقة ثنائية الدهون.

لمراقبة أنشطة قناة gramicidin A ، قم بتطبيق 100 مللي فولت عبر الغشاء بمعدل عينة يبلغ 5 كيلو هرتز لقياس إمكانات الاحتفاظ بالغشاء. سجل الخصائص الكهربائية كما تم القيام بها سابقا ، بالنقر فوق زر التسجيل. عند عرض أنشطة القناة الأيونية ، استمر في التسجيل حتى يتم ملاحظة قفزات تيار مختلفة لتأكيد دمج القناة الأيونية.

بمجرد التأكيد ، قم بإنهاء التسجيل بالنقر فوق أيقونة المربع الأسود. عند الانتهاء من التسجيل ، قم بتصفية البيانات باستخدام مرشح التمرير المنخفض عند 100 هرتز باستخدام برنامج الفيزيولوجيا الكهربية. لاحظ القفزات الحالية في البيانات المحتملة التي تمت تصفيتها

تمثل هذه القفزات تعتيم قناة أيونية gramicidin A. عندما تم إحضار سلائف الغشاء المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة لإذابة الجليد ، يتم تسهيل تكوين الطبقة الدهنية الثنائية بسبب استخراج المذيب الكارهة للماء في الأغشية الرقيقة PDMS. يظهر هذا التسلسل من الصور تكوين طبقة ثنائية دهنية ، والتي تتجمع ذاتيا عند تسخينها من شكلها المتجمد.

هنا ، يوضح التوصيل الكهربائي دمج وتعقيم الجراميسيدين أ.عند التضليل ، يشكل الجراميسيدين أ قناة أيونية وتقفز مستويات التوصيل إلى 28 بيكوسيمين ، وهو ما يتوافق مع نتائج التقارير السابقة ويظهر الدمج الفوري لهذا المضاد الحيوي في الطبقة الثنائية. توفر تقنية تكوين الغشاء الخاصة بنا أداة قوية لدراسات غشاء الخلية والقنوات النانوية على عكس التقنيات التقليدية التي لها إمكانات محدودة للتطبيق العملي. لا يتطلب نظامنا أي خبرة في تكوين الغشاء أو دمج التوجيه الأيوني ، مما يجعله مناسبا تماما لفحص الأدوية وتطبيقات الاستشعار الحيوي.