إعادة تشكيل الأساسي الميتوزى المغازل في كروية مستحلب قطرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة تشكيل هياكل شبيهة بالمغزل الانقسامي ضمن الحصر الهندسي لقطيرات مستحلب الماء في الزيت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تجميع المغزل الانقسامي، مثل كيفية تحديد مواقع المغازل وتجميعها، وما هي المساهمة المحددة للمكونات الفردية في هذه العمليات؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام نهج التصاعد (bottom-up) لإعادة تشكيل هياكل شبيهة بالمغزل ضمن حصر هندسي يحاكي شكل الخلية في مرحلة الانقسام الميتوزي.

يمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لدراسة عمليات أخرى تعتمد على الحصر الخلوي. امزج 10 أجزاء من بوليمر PDMS الأولي مع جزء واحد من عامل المعالجة بكتلة إجمالية تبلغ حوالي 40 grams. ثم، ضع المزيج في غرفة تفريغ لمدة 30 minutes تقريباً لإزالة فقاعات الهواء.

في هذه الأثناء، قم بلف ورق الألومنيوم حول القالب لتشكيل وعاء بعمق 1 cm وقطر 4 inch. وعند الجاهزية، صب حوالي 3/4 من خليط PDMS في القالب. بعد ذلك، أعِد PDMS إلى غرفة التفريغ لمدة 30 دقيقة أخرى.

بعد إزالة الغازات، قم بمعالجة PDMS لمدة ساعة واحدة عند 100 درجة مئوية. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز بعض الشرائح الزجاجية لعملية الطلاء الدوراني عن طريق تنظيفها من الغبار باستخدام الهواء المضغوط. بعد ذلك، قم بطلاء ما تبقى من خليط PDMS دورانيًا على الشرائح.

قم بمعالجة هذه الشرائح لمدة ساعة واحدة عند 100 درجة Celsius لتقسية الـ PDMS. بعد ذلك، قم بإزالة الـ PDMS برفق باستخدام شفرة حلاقة، ثم اثقب الثقوب المطلوبة في شرائح الـ PDMS لصنع رقائق مائعية دقيقة. الآن، قم بمعالجة الرقاقة المائعية الدقيقة وشريحة زجاجية مطلية بـ PDMS باستخدام تفريغ كورونا لبضع ثوانٍ.

أخيرًا، ضع شريحة مائعية دقيقة على كل شريحة زجاجية بحيث تكون القنوات متجهة لأسفل، وقم بتسخين الشرائح طوال الليل عند 100 درجة Celsius. أولاً، وباستخدام أدوات زجاجية مغسولة بالكلوروفورم، قم بتحضير حوالي 250 micrograms من الدهون المذابة في الكلوروفورم. جفف خليط الدهون بعناية باستخدام غاز خامل.

ثم ضعها في غرفة تفريغ لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بإذابة الدهون في زيت معدني ومادة خافضة للتوتر السطحي بتركيز 2.5% لتصل إلى تركيز 0.5 mg/mL، وهو ما يعادل حوالي 500 µL. ولإذابة الدهون تماماً، قم بمعالجة الخليط بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة عند تردد 40 kHz.

بعد ذلك، قم بطلاء الـ PDMS بطريقة التدوير (spin coat) على أغطية الشرائح الزجاجية بسمك يتناسب مع عدسة المجهر الشيئية. ثم، قم بطلاء الـ PDMS بطريقة التدوير على شرائح زجاجية. الآن، قم بمعالجة أغطية الشرائح والشرائح الزجاجية المطلية بالـ PDMS لمدة ساعة واحدة عند 100 °C.

بعد ذلك، قم بتجهيز خلايا التدفق عن طريق وضع شرائح رقيقة من فيلم الختم المختبري بتباعد دقيق على شرائح زجاجية مغطاة بـ PDMS. ضع شرائط بعرض 3 mm وبفاصل 2 mm تقريباً بين كل منها. ثم، غطِّ خلايا التدفق بشريحة غطاء مغطاة بـ PDMS، وأحكم إغلاق التجميع عن طريق صهر الفيلم عند 100 °C لمدة دقيقة واحدة.

بعد التسخين، اضغط غطاء الشريحة لأسفل برفق وأحكم إغلاقه باستخدام Valap. بعد ذلك، قم بتجهيز كوب PDMS للتصوير طويل الأمد. اصنع ثقباً بقطر 4 mm في شريحة من PDMS بسمك 3 mm.

بعد ذلك، قم بمعالجة شريحة PDMS وشريحة زجاجية مغطاة بـ PDMS باستخدام تفريغ الكورونا. وبمجرد معالجتهما، ضعهما فوق بعضهما البعض، ثم قم بخبز التجميع طوال الليل عند 100 درجة Celsius. راقب تكون القطيرات باستخدام مجهر الحقل المضيء المقلوب.

قم بتوصيل الطور الزيتي الليبيدي بجهاز التحكم في الضغط، وزد الضغط حتى تخرج قطرة من الزيت من أنبوب الذروة. قم بتوصيل أنبوب الذروة بالمدخل الثاني لشريحة الموائع الدقيقة. بعد ذلك، املأ شرائح الموائع الدقيقة تماماً بالطور الزيتي الليبيدي من المدخل الثاني.

بعد ذلك، قم بإدخال الطور المائي القائم على MRB-80 من المدخل الأول. تحكم في حجم القطرات عن طريق تغيير ضغوط الطور الزيتي الدهني والطور المائي لإنشاء قطرات بقطر يبلغ حوالي 15 microns. ويعد ضبط ضغط الطور الزيتي الدهني عند حوالي 800 millibar، والطور المائي عند 200 millibar، نقطة بداية جيدة.

بعد الحصول على حجم القطيرات المطلوب، املأ خلية التدفق بالقطيرات تماماً. يتم تكوين هذه القطيرات باستخدام أحجام صغيرة من الطور المائي. وهذا يعني أن إعداد الموائع الدقيقة يجب أن يعمل بسرعة لتجنب فقدان الطور المائي بالكامل قبل تكوين قطيرات بالحجم الصحيح.

بمجرد الملء، أغلق نهايات خلية التدفق بعناية باستخدام Valap. إذا لم تتوقف القطيرات عن الحركة، فهذا يعني أن الختم غير مكتمل، أو ربما تسللت فقاعات هوائية. للتصوير طويل الأمد، انقل القطيرات إلى كوب PDMS، وقم بتغطيتها بطبقة من خليط الزيت والليبيد.

أذِب الجسيمات المركزية في درجة حرارة الغرفة، ثم ضعها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لضمان تنوي microtubule بشكل صحيح. وأثناء الانتظار، قم بتحضير خليط المقايسة على الثلج. يجب أن يحتوي هذا الخليط على tubulin، وGTP، ونظام لإزالة الأكسجين، ومولدات قوة جزيئية مثل microtubule cross-linkers، وATP، ونظام تجديد ATP.

بعد الخلط، قم بتدوير العينة في جهاز Airfuge المبرد عند ضغط 30 psi لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، أضف الجسيمات المركزية المسخنة مسبقاً إلى الخليط. قم بتحسين كمية الجسيمات المركزية المضافة للحصول على جسيم مركزي واحد أو اثنين لكل قطرة.

بعد ذلك، استخدم هذا الخليط لإنتاج قطيرات مستحلب كما تم وصفه سابقاً. ومن أجل جذب الداينين إلى الدهون المبيوتنة عند قشرة القطيرة، أضف GFP-dynein TMR والستريبتفيدين إلى الطور المائي. وباستخدام مجهر بؤري دوار القرص، قم بتصوير نمو الأنابيب الدقيقة بعد مرور 30 دقيقة عند 26 degrees Celsius.

أثناء التصوير، يمكن تعزيز نمو الأنابيب الدقيقة عن طريق رفع درجة الحرارة إلى 28 أو حتى 30 درجة Celsius. وبالنسبة للإسقاطات المحورية Z-projections، يتم التقاط مجموعات من الصور بفواصل قدرها one micron، وهو ما يتطلب عادةً حوالي 20 صورة لكل قطرة. انتقل إلى لوحة الكاميرا الرئيسية، وانقر على Edit Z، ثم اضبط Z Step على 1.0.

انقر على "التالي" (Next) لحفظ الإعدادات. بعد ذلك، حدد الحد الأقصى لكسب مضخم الإلكترونات (EM Gain) الخطي من خلال النقر على علامة تبويب "الكاميرا" (Camera) في لوحة "الاستحواذ" (Acquisition)، وتحريك شريط EM Gain إلى 300. ثم، اضبط "وقت التعريض" (Exposure Time) على 200 milliseconds في علامة التبويب نفسها.

انقر على Record لحفظ الإعدادات. وبالنسبة لتجارب التصوير الحي، قم بإجراء مساقط Z (Z Projections) كل دقيقتين لمدة ساعتين من خلال تقليل أزمنة التعريض إلى حوالي 100 milliseconds، وزيادة فواصل Z إلى 2 microns. وفي تجارب التصوير الحي، استخدم كوب PDMS بدلاً من خلية التدفق العادية لضمان أقصى تثبيت للعينة.

باستخدام البروتوكولات الموصوفة، تمت دراسة تكوين الكويكبات في قطرات مستحلب مائية زيتية تحتوي على جسيمات مركزية. في البداية، تنتشر الجسيمات المركزية بحرية داخل الأحجام المحصورة. وبعد حوالي 20 إلى 30 دقيقة، تصبح الأنيبيبات الدقيقة الأولى مرئية، ويصبح انتشار الجسيمات المركزية مقيداً مع نمو الأنيبيبات الدقيقة باتجاه القشرة في جميع الاتجاهات.

عندما تنمو الأنابيب الدقيقة لتصبح أطول من نصف قطر القطرة، تُدفع الجسيمات المركزية إلى الحدود المتقابلة، مع نمو الأنابيب الدقيقة على طول قشرة القطرة. في غياب الستربتافيدين، يكون الداينين منتشرًا داخل القطرة. ومع ذلك، وبوجود الستربتافيدين، يترابط الداينين بالدهون المبيوتنة خلال حوالي 10 دقائق من تشكل القطرة.

عند فحص التيوبولين الفلوري في وجود الداينين القشري، يتضح أن الجسيمات المركزية تتمركز في المنتصف. بينما في حالة غياب الداينين، تندفع الجسيمات المركزية نحو جوانب متقابلة من القطرة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى قيام الداينين بتحفيز كوارث الأنيبيبات الدقيقة وقوى السحب القشرية، مما يؤدي إلى تمركز الكويكبات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات الموائع الدقيقة لإنشاء تراكيب تشبه المغزل داخل قطرات مستحلب كروية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمام عملية تكوين القطرات وتصويرها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات عند تنفيذها بشكل صحيح. وباستخدام هذا الإجراء، يمكن تغليف عوامل تجميع مغزلية أخرى لدراسة تأثيرها على شكل المغزل وموضعه.

يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات، عند استخدام الكلوروفورم أو PDMS.