التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF
February 18th, 2022
هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.
تحتوي صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية على مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة ذات الخصائص الديناميكية المميزة كما هو مطلوب للوظيفة. يتناول هذا البروتوكول كيف يمنح النشاط الجماعي للمنظمين مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة القريبة ذات خصائص متميزة. تمكننا عملية الاسترداد هذه من أسفل إلى أعلى من تصور تنظيم وديناميات مجموعات الأنابيب الدقيقة القريبة مثل الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم في وقت واحد ، وفك رموز الآليات الكامنة وراء تنظيمها الذاتي.
تتطلب إعادة التشكيل متعددة المكونات تحسين المعلمات التجريبية مثل الرقم الهيدروجيني والقوة الأيونية وتركيز البروتين مع الحفاظ على نشاط كل منها. التحليل المنهجي للمكونات الفردية قبل فحوصات البروتين المتعدد مفيد للغاية. للبدء ، ماصة خليط من 4.5 ميكرولتر من BRB ADDTT في ميكرولتر واحد من محلول microtubule على شريحة المجهر.
قم بتغطيتها بغطاء 18 × 18 ملم وأغلق الحواف إما بطلاء أظافر شفاف أو مانع تسرب VALAP. ضع هدف TIRF أسفل الغطاء الزجاجي. تصور الأنابيب الدقيقة المبلمرة حديثا بطول موجي مناسب للتوبولين المسمى بالفلورسنت في المزيج الساطع لتحديد تخفيف الأنابيب الدقيقة لاستخدامها في التجارب القادمة.
حدد كثافة الليزر للتجربة تجريبيا بحيث تكون جميع البروتينات الفلورية مضاءة ، ولكنها لا تخضع لتبييض ضوئي كبير على مدار فترة التجربة. اضبط درجة حرارة المجهر على 28 درجة مئوية لعرض الأنابيب الدقيقة الديناميكية. استخدم ورق العدسة لتنظيف هدف 100X باستخدام 70٪ من الإيثانول.
استخدم أفضل مزيج من مكعبات المرشح ومرشحات الانبعاثات اعتمادا على قنوات الفلورسنت المراد تصويرها. قم بإعداد تسلسل التصوير. لإجراء تجربة مع 647 نانومتر من الأنابيب الدقيقة البيوتينيل الموسومة بالفلوروفور ، و 560 نانومتر من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل في توبولين القابل للذوبان ، والبروتين المسمى GFP المثير للاهتمام ، قم بتصوير قنوات 488 نانومتر و 560 نانومتر و 647 نانومتر كل 10 ثوان لمدة 20 أي دقيقة.
لالتقاط صورة مرجعية للحزم قبل إضافة التوبولين القابل للذوبان والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، قم بإعداد تسلسل مع صورة واحدة لكل منها في قنوات الطول الموجي 560 نانومتر و 647 نانومتر. تحقق من موضع شعاع الليزر على السقف فوق المجهر وقم بإجراء تغييرات على الشعاع باستخدام البرنامج. تأكد من محاذاة مصباح الليزر.
قبل التصوير ، أضف قطرة من زيت غمر المجهر إلى الهدف. تحضير خليط توبولين القابل للذوبان مع الاحتفاظ به على الجليد وتدوير الخليط. لشل حركة الأنابيب الدقيقة عبر وصلة البيوتين-نيوترافيدين-البيوتين، تدفق أولا في حوالي 7.5 ميكرولتر من محلول نيوترافيدين حتى تمتلئ الغرفة وتحضن لمدة خمس دقائق.
يغسل مع 10 ميكرولتر من MB الباردة. تدفق في 7.5 ميكرولتر من البروتين المانع KC وحضانت لمدة دقيقتين. يغسل مع 10 ميكرولتر من MB دافئة لإعداد الغرفة لإدخال microtubules.
قم بتخفيف مخزون الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في BRB ADDTT وأضف ميكرولتر واحد من هذا التخفيف إلى تسعة ميكرولترات من MB الدافئة. تدفق الخليط إلى الغرفة واحتضان لمدة 10 دقائق. اغسل الأنابيب الدقيقة غير المجمدة مع 10 ميكرولترات من MB الدافئة.
تدفق 7.5 ميكرولتر من KC الدافئ إلى الغرفة واحتضان لمدة دقيقتين. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول نانومولي من الوصلة المتقاطعة أو البروتين PRC1 في KC وقم بتدوير المحلول. تدفق 10 ميكرولترات من هذا المحلول إلى غرفة التصوير واحتضان لمدة خمس دقائق.
لصنع حزم ، قم بتدفق 10 ميكرولترات من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل إلى الغرفة واحتضنها لمدة 10 دقائق. اغسل الغرفة مرتين مع 10 ميكرولتر من MB دافئة. خلال فترة الحضانة التي تبلغ 10 دقائق ، قم بإعداد 10 ميكرولترات من خليط الفحص الذي يحتوي على بروتينات ذات أهمية ، توبولين قابل للذوبان ، نيوكليوتيدات ، زبالة الأكسجين ، ومضادات الأكسدة وقم بتدويرها.
حافظ على الخليط على الجليد. قم بتحميل غرفة التصوير المعدة المسجلة على حامل الانزلاق على هدف 100X TIRF. استخدم قنوات 560 نانومتر و 647 نانومتر للعثور على مجال رؤية يحتوي على العدد الأمثل والكثافة من الأنابيب الدقيقة والحزم المفردة.
بمجرد تحديد مجال الرؤية، التقط صورة مرجعية. تدفق بعناية في خليط الفحص دون إزعاج غرفة التصوير. أغلق الأطراف المفتوحة للغرفة باستخدام مانع التسرب VALAP.
راقب الأنابيب الدقيقة وابدأ تسلسل التصوير. بعد شل حركة بذور الأنابيب الدقيقة وتوليد الحزم ، تم الحصول على صور التألق. تم تحديد الأنابيب الدقيقة المفردة بواسطة إشارة الفلورسنت في قناة 647 نانومتر ، في حين تم تحديد الأنابيب الدقيقة كحزم سابقة التشكيل عندما عرضت إشارات الفلورسنت في كلتا القناتين.
تمت دراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة المفردة وحزم PRC1 المتقاطعة في وجود البروتينات KIF4A و CLASP1 ، والتي كشفت أن الأنابيب الدقيقة المفردة تستطيل على مدار الفحص ، في حين أن نمو الأنابيب الدقيقة المتقاطعة متوقف. احرص على الحفاظ على الأنابيب الدقيقة المبلمرة في درجة حرارة الغرفة أو فوقها. احتفظ بالتوبولين القابل للذوبان على الجليد وقم بحماية غرفة التصوير والأنابيب الدقيقة والبروتينات ذات العلامات الفلورية من الضوء.
قدمت هذه الفحوصات نظرة ميكانيكية حول كيفية قيام وحدة البروتين الموجودة في المغزل الانقسامي بتنظيم ديناميكيات مجموعتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة التي تتعايش في المغزل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة فحصًا قائمًا على مجهر TIRF لإعادة التركيب in vitro لتحديد كميات و比較 ديناميكيات مجموعات الأنابيب الدقيقة المختلفة. تسمح الطريقة للتصوير المتزامن للنشاط الجماعي للبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة على كل من الأنابيب الدقيقة المفردة وحزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الخلوية
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- تتكون صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية من مجموعات فرعية ذات خصائص ديناميكية فريدة.
- فهم النشاط الجماعي للمنظمين أمر بالغ الأهمية لفك طلاسم سلوك الأنابيب الدقيقة.
- تركز هذه الدراسة على آليات التنظيم الذاتي لمجموعات الأنابيب الدقيقة.
- تحسين المعلمات التجريبية أمر ضروري لنجاح إعادة التركيب متعددة المكونات.
غرض الدراسة
- لتصوير تنظيم وديناميكات مجموعات الأنابيب الدقيقة القريبة.
- للتحقيق في الآليات الكامنة وراء التنظيم الذاتي للأنابيب الدقيقة.
- لمقارنة ديناميكيات مجموعات الأنابيب الدقيقة المختلفة.
الطرق المستخدمة
- مجهر TIRF للمراقبة في الوقت الحقيقي.
- فحص إعادة التركيب in vitro لديناميات الأنابيب الدقيقة.
- تحسين درجة الحموضة، القوة الأيونية، وتركيز البروتين.
- تحليل منهجي للمكونات الفردية قبل تجارب البروتينات المتعددة.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للأنابيب الدقيقة المفردة والحزم.
- خصائص ديناميكية مميزة لوحظت بين المجموعات الفرعية للأنابيب الدقيقة.
- رؤى حول النشاط الجماعي للبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة.
- إنشاء بروتوكول موثوق به للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- يوفر الفحص أداة قوية لدراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.
- فهم سلوك الأنابيب الدقيقة ضروري للحصول على رؤى حول الوظائف الخلوية.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه المنهجية لاستكشاف المكونات الخلوية الأخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay enables simultaneous visualization of distinct microtubule subpopulations, providing mechanistic insights into how regulatory proteins differentially modulate microtubule dynamics. The method supports target validation by de-risking mechanistic hypotheses about protein function in cytoskeletal organization. It offers predictive value for screening compounds that influence microtubule stability or bundling in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing how proteins like KIF4A and CLASP1 differentially regulate single versus crosslinked microtubule dynamics.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of protein localization and activity on defined microtubule subsets.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying synergistic or antagonistic effects of protein regulators on microtubule stability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated microtubule systems (single and bundled) for downstream compound screening under identical conditions.
- Quantitative Output: Generates real-time dynamic measurements (elongation, growth stall) enabling dose-response analysis of modulators.
- Reproducibility: Standardized immobilization and imaging protocols ensure consistent visualization of microtubule populations across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models mitotic spindle microtubule subsets, relevant to oncology targets involved in cell division.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to cellular phenotypes by linking protein activity to microtubule network organization.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs preclinical advancement by identifying compounds that selectively alter bundled versus single microtubule dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling mechanistic de-risking before phenotypic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how regulators organize proximal microtubule populations with distinct dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative readouts on microtubule elongation and bundling for compound evaluation.
- Analytics: Provides dynamic parameters (growth rates, stall events) that allow comparison of protein or compound effects across conditions.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular function by modeling mitotic spindle microtubule subpopulations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying cytoskeletal regulators across multiple targets and protein classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanism by de-risking ambiguous cytoskeletal effects.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chamber preparation, temperature control, and multi-channel imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing subtype-specific microtubule responses early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on selective effects on bundled versus single microtubules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TIRF microscopy, microtubule purification, and protein labeling techniques.
- Depends on instrumentation capable of multi-color TIRF imaging and environmental control (28°C).
- Necessitates cross-team standardization of microtubule immobilization and buffer conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cytoskeletal proteins or crosslinkers beyond PRC1.
- Limited by the need to maintain microtubule stability and prevent photobleaching during extended imaging sessions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Microtubule Visualization via TIRF Microscopy
1:58
Microscope Settings
3:17
Generation of Surface-Immobilized Microtubule Bundles
4:57
Image Microtubule Dynamics
5:53
Results: TIRF Microscopy of Crosslinked and Single Microtubules
6:35
Conclusion
