إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية
سبتمبر 25, 2016
الأساليب التقليدية لبدء التمايز القلب تعليق مجموع المباراتين على أساس من المحفزة الإنسان ينبع الخلايا (hPSCs) تعاني مع عدم تجانس الثقافة فيما يتعلق حجم الكلي والشكل. هنا، نحن تصف طريقة قوية للتمايز القلب توظيف microwells لتوليد تسيطر عليها حجم hPSC المجاميع مثقف في ظل الظروف التي تشجع القلب.
أولا ، جهاز الطرد المركزي لخلية جذعية بشرية متعددة القدرات أحادية الخلية ، أو تعليق HPSC ، بمعدل 200 مرة جرام لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط وسط الغسيل ، وأعد تعليق الخلايا في وسط التجميع ، بكثافة 1.2 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بزرع مليلتر واحد من تعليق الخلية في كل بئر على لوحة microwell المعدة ، وقم بتوزيع الخلايا بالتساوي.
لزرع عدد كبير من الآبار ، قم بتدوير تعليق الخلية بشكل دوري لمنع الاستقرار. بعد البذر ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، راقب اللوحة الموجودة أسفل المجهر للتأكد من أن الخلايا قد نسبت إلى قاع كل بئر صغير.
بعد ذلك ، احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ C-O اثنين ، 5٪ O اثنين من نقص الأكسجة. بعد يوم واحد من التجميع ، افحص الركام تحت المجهر. بالمقارنة مع التجميع الفوري بعد أجهزة الطرد المركزي ، يجب أن تظهر سليمة مع حواف ناعمة.
قم بإزالة المادة الطافية عن طريق إمساك لوحة البئر الصغيرة أفقيا ، ووضع طرف ماصة دقيقة P-1000 على سطح وسط الاستزراع ، وعلى حافة البئر. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط ببطء ، مع الحرص على عدم إزعاج الركام في قاع الآبار الصغيرة. بعد تقليل المستوى المتوسط إلى حوالي ملليمتر إلى ملليمترين من سطح البئر الصغير المحكم ، قم بإمالة اللوحة ببطء ، واستنشق الوسط المتبقي ببطء من البئر.
أضف مليليتا واحدا من وسط الحث المحضر حديثا في المرحلة الأولى عن طريق تثبيت طرف الماصة على الحافة الداخلية للبئر ، وتوزيع الوسط ببطء شديد على الجدار الداخلي للبئر. أعد اللوحة إلى الحاضنة في ظل ظروف نقص الأكسجين لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الرابع ، استخدم ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر لحصاد الركام من كل بئر من صفيحة الآبار الصغيرة.
اجمع ما يصل إلى 10 آبار من التعليق الكلي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اترك الركام يستقر لمدة 15 دقيقة في حاضنة نقص الأكسجين. بعد أن تستقر الركام ، قم بشفط المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الركام في عشرة ملليلتر من وسط الغسيل الدافئ مسبقا ، لإزالة السيتوكينات الاستقرائية المتبقية.
الطرد المركزي الركام عند 50 مرة جم لمدة دقيقتين. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الركام المحبب في وسط الحث في المرحلة الثانية الدافئة مسبقا. انقل التعليق الكلي إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية سعة 24 بئرا بمعدل ملليلتر واحد لكل بئر.
راقب الركام تحت المجهر كمجموعات خلايا ضيقة موحدة. احتضن في ظل ظروف نقص الأكسجين حتى اليوم السادس. في اليوم السادس ، قم بتجميع ما يصل إلى 10 ملليلتر من الركام لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر كما كان من قبل.
بعد أن تستقر الركام ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الركام في وسط الحث في المرحلة الثالثة الدافئة مسبقا. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر، أعد توزيع الركام في لوح تثبيت منخفض للغاية مكون من 24 بئرا، بمعدل مليلتر واحد لكل بئر. قم بإجراء تغيير متوسط كامل في اليوم 10 من الثقافة.
في اليوم 12 ، انقل الخلايا إلى ظروف الثقافة النورموكسية من 20٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للفترة المتبقية من فترة الاستزراع. بعد 12 يوما من التمايز ، وهو ما يعادل ستة أيام في مرحلة تحريض القلب ، لوحظت تقلصات متوسطة وقوية على نطاق المجموع. في اليوم 17 ، 74.8٪ من الخلايا إيجابية للتروبونين القلبي T ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، كما يتضح من الجزء المملوء من الرسم البياني.
تظهر أيضا خلايا ملطخة بالجسم المضاد الثانوي وحده ، كما هو موضح في القسم غير المملوء من الرسم البياني. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم غسل الركام جيدا في اليوم الرابع ، لإزالة المستويات النزرة من السيتوكينات ، وتحديدا activin-A ، الذي يعزز تمايز الأديم الباطن ، على حساب تحريض القلب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الثقافة الباردة لأنواع الخلايا الاستقرائية داخل المجموع ، للإجابة على أسئلة أخرى ، مثل كيف تؤثر إشارات paracrine من الأنسجة الجنينية المجاورة على تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في سلالة القلب.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة قوية للتمايز القلبي للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الآبار الدقيقة (microwells) لتوليد تجمعات محكومة الحجم. وتعالج هذه الطريقة مشكلات عدم التجانس في المزارع الخلوية المرتبطة بالتقنيات التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- التمايز القلبي
- هندسة الأنسجة
خلفية علمية
- يمكن للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا القلبية.
- غالبًا ما تؤدي الطرق التقليدية إلى تكوين تجمعات ذات أحجام وأشكال متفاوتة، مما يؤثر على نتائج التمايز.
- توفر تقنية الآبار الدقيقة حلًا لإنتاج تجمعات موحدة.
- تعد الظروف المحفزة للتمايز القلبي ضرورية لتحقيق تمايز فعال.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتوليد تجمعات من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (hPSC) ذات أحجام مضبوطة.
- تحسين اتساق نتائج التمايز القلبي.
- تسهيل المزيد من الأبحاث في مجال هندسة الأنسجة القلبية.
الطرق المستخدمة
- طرد مركزي لمعلق الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) لتكوين تجمعات خلوية.
- استخدام أطباق ذات آبار دقيقة للتحكم في حجم التجمعات الخلوية.
- الحضن تحت ظروف نقص الأكسجين لتحفيز التمايز القلبي.
- تغييرات متتابعة في الوسط الغذائي لتحفيز مراحل التمايز.
النتائج الرئيسية
- تم تكوين تجمعات متجانسة والحفاظ عليها طوال عملية التمايز.
- لوحظ تعبير ملحوظ عن cardiac troponin T في الخلايا المتمايزة.
- أدى التحسين في إزالة السيتوكينات المحفزة إلى تعزيز الالتزام بالسلالة القلبية.
- لوحظت انقباضات شملت التجمعات بأكملها بعد 12 يوماً من التمايز.
الاستنتاجات
- توفر طريقة الآبار الدقيقة نهجاً موثوقاً للتمايز القلبي للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs).
- تؤدي التجمعات ذات الحجم المتحكم به إلى نتائج تمايز أكثر اتساقاً.
- يمكن تطبيق هذه التقنية لإجراء مزيد من الاستقصاء حول التطور القلبي ونمذجة الأمراض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج التحكم في حجم التجمعات الخلوية في عملية التمايز القلبي القائمة على التعليق عقبة رئيسية في إنتاج الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)، وهي عدم تجانس المزارع الخلوية الذي يؤدي إلى تباين في الإنتاجية. ومن خلال فرض تكوين تجمعات موحدة عبر تقنية الآبار الدقيقة، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في نتائج التمايز، مما يدعم توليد نماذج قبل سريرية قابلة للتطوير والتكرار. وهذا يجعل هذا النهج أداة استراتيجية لتقليل المخاطر المتعلقة بالالتزام بالسلالة القلبية في سير عمل الاكتشاف المبكر والبحوث الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء مسارات الإشارات المعتمدة على الحجم في الحث القلبي، مما يوضح المحركات الميكانيكية لتحديد السلالة الخلوية.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين في تكوين التجمعات الخلوية، مما يحسن من إمكانية تكرار النتائج عبر التجارب والفرق المختلفة.
- القيمة التنبؤية: تدعم نمذجة الاستجابة للجرعة عند التعرض للمورفوجينات من خلال توحيد هندسة التجمعات الخلوية كمتغير مضبوط.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج أنسجة دقيقة موحدة ومناسبة للتصوير عالي المحتوى والتقدير الكمي للخلايا العضلية القلبية القائم على قياس التدفق الخلوي.
- القابلية للتوسع: يتيح تنسيق لوحة الآبار الدقيقة المعالجة المتوازية لظروف متعددة أو خلفيات جينية مختلفة لأغراض الفحص المقارن.
- المخرجات الكمية: تُمكِّن من القياس المتسق للخلايا الموجبة لـ cardiac troponin T كمؤشر وظيفي لدراسات الاضطراب الجيني أو تأثير المركبات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- نظام ذو صلة بالمرض: يُنتج تجمعات قلبية متجانسة وقابلة للتوسع لنمذجة اعتلالات عضلة القلب الوراثية أو السمية القلبية الناجمة عن الأدوية.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة التمايز في مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال توفير مواد خلوية متسقة بين الدفعات الإنتاجية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يقلل من المتغيرات المربكة الناتجة عن عدم تجانس حجم التجمعات، مما يزيد الثقة في الارتباطات بين النمط الظاهري والنمط الجيني.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية من خلال تمكين التمايز المعياري للخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC)، وهو ما يخدم التطبيقات اللاحقة مثل نمذجة الأمراض، وعلم الصيدلة الخاص بالسلامة، وتقييم المرشحين في الطب التجديدي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول الإشارات الفيزيائية الحيوية في تحديد السلالة القلبية من خلال التحكم الدقيق في حجم التجمعات وشكلها.
- الفحص: توفر مصفوفات أنسجة دقيقة قابلة للتكرار لفحص مكتبات المركبات، مع تقليل الضوضاء الناتجة عن تباين التجمعات.
- التحليلات: تسهل قراءات قياس التدفق الخلوي والتصوير الكمي (على سبيل المثال، cardiac troponin T) مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بفضل تجانس التجمعات الخلوية.
- الأبحاث الانتقالية: توفر مصدراً قابلاً للتوسع للخلايا العضلية القلبية من أجل المقايسات الوظيفية قبل السريرية، بما في ذلك القدرة على الانقباض والفيزيولوجيا الكهربائية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: يمكن إعادة استخدام ألواح الآبار الدقيقة عبر مشاريع وخطوط خلوية مختلفة، مما يدعم التقييس على مستوى المنصة في سير عمل تمايز الخلايا الجذعية.
الأثر التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: زيادة الثقة التنبؤية في نتائج التمايز من خلال تقليل الضجيج البيولوجي الناتج عن تباين حجم التجمعات.
- القيمة التشغيلية: تعزيز إمكانية التكرار والإنتاجية عبر تكوين تجمعات موحدة وقابلة للتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين الثقة في قرارات الاستمرار أو التوقف في البرامج القلبية المبكرة عن طريق تقليل السلبيات الكاذبة الناتجة عن التمايز غير الفعال.
- التأثير على المحفظة: تمكين تخصيص الموارد المعدلة حسب المخاطر بناءً على مقاييس موثوقة لعائد الخلايا العضلية القلبية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)، والتعامل مع التجمعات الخلوية، وأنظمة الحضن في ظروف نقص الأكسجين.
- يعتمد على توفر أطباق الآبار الدقيقة ذات أبعاد آبار محددة وأسطح منخفضة الالتصاق.
- يستلزم بروتوكولات موحدة لاستبدال الوسط الغذائي لتجنب تفكك التجمعات الخلوية أثناء خطوات الغسل.
- يتطلب التحقق من الصحة عبر خطوط مختلفة من hPSC لضمان اتساق العلاقات بين الحجم وكفاءة التمايز.
- يقتصر بضرورة توفر معدات متخصصة (حضانات نقص الأكسجين، وأطباق منخفضة الالتصاق) وخطوات غسل محسنة للسيتوكينات لمنع التمايز غير المستهدف.
