إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

أولا ، جهاز الطرد المركزي لخلية جذعية بشرية متعددة القدرات أحادية الخلية ، أو تعليق HPSC ، بمعدل 200 مرة جرام لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط وسط الغسيل ، وأعد تعليق الخلايا في وسط التجميع ، بكثافة 1.2 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بزرع مليلتر واحد من تعليق الخلية في كل بئر على لوحة microwell المعدة ، وقم بتوزيع الخلايا بالتساوي.

لزرع عدد كبير من الآبار ، قم بتدوير تعليق الخلية بشكل دوري لمنع الاستقرار. بعد البذر ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، راقب اللوحة الموجودة أسفل المجهر للتأكد من أن الخلايا قد نسبت إلى قاع كل بئر صغير.

بعد ذلك ، احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ C-O اثنين ، 5٪ O اثنين من نقص الأكسجة. بعد يوم واحد من التجميع ، افحص الركام تحت المجهر. بالمقارنة مع التجميع الفوري بعد أجهزة الطرد المركزي ، يجب أن تظهر سليمة مع حواف ناعمة.

قم بإزالة المادة الطافية عن طريق إمساك لوحة البئر الصغيرة أفقيا ، ووضع طرف ماصة دقيقة P-1000 على سطح وسط الاستزراع ، وعلى حافة البئر. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط ببطء ، مع الحرص على عدم إزعاج الركام في قاع الآبار الصغيرة. بعد تقليل المستوى المتوسط إلى حوالي ملليمتر إلى ملليمترين من سطح البئر الصغير المحكم ، قم بإمالة اللوحة ببطء ، واستنشق الوسط المتبقي ببطء من البئر.

أضف مليليتا واحدا من وسط الحث المحضر حديثا في المرحلة الأولى عن طريق تثبيت طرف الماصة على الحافة الداخلية للبئر ، وتوزيع الوسط ببطء شديد على الجدار الداخلي للبئر. أعد اللوحة إلى الحاضنة في ظل ظروف نقص الأكسجين لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الرابع ، استخدم ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر لحصاد الركام من كل بئر من صفيحة الآبار الصغيرة.

اجمع ما يصل إلى 10 آبار من التعليق الكلي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اترك الركام يستقر لمدة 15 دقيقة في حاضنة نقص الأكسجين. بعد أن تستقر الركام ، قم بشفط المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الركام في عشرة ملليلتر من وسط الغسيل الدافئ مسبقا ، لإزالة السيتوكينات الاستقرائية المتبقية.

الطرد المركزي الركام عند 50 مرة جم لمدة دقيقتين. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الركام المحبب في وسط الحث في المرحلة الثانية الدافئة مسبقا. انقل التعليق الكلي إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية سعة 24 بئرا بمعدل ملليلتر واحد لكل بئر.

راقب الركام تحت المجهر كمجموعات خلايا ضيقة موحدة. احتضن في ظل ظروف نقص الأكسجين حتى اليوم السادس. في اليوم السادس ، قم بتجميع ما يصل إلى 10 ملليلتر من الركام لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر كما كان من قبل.

بعد أن تستقر الركام ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الركام في وسط الحث في المرحلة الثالثة الدافئة مسبقا. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر، أعد توزيع الركام في لوح تثبيت منخفض للغاية مكون من 24 بئرا، بمعدل مليلتر واحد لكل بئر. قم بإجراء تغيير متوسط كامل في اليوم 10 من الثقافة.

في اليوم 12 ، انقل الخلايا إلى ظروف الثقافة النورموكسية من 20٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للفترة المتبقية من فترة الاستزراع. بعد 12 يوما من التمايز ، وهو ما يعادل ستة أيام في مرحلة تحريض القلب ، لوحظت تقلصات متوسطة وقوية على نطاق المجموع. في اليوم 17 ، 74.8٪ من الخلايا إيجابية للتروبونين القلبي T ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، كما يتضح من الجزء المملوء من الرسم البياني.

تظهر أيضا خلايا ملطخة بالجسم المضاد الثانوي وحده ، كما هو موضح في القسم غير المملوء من الرسم البياني. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم غسل الركام جيدا في اليوم الرابع ، لإزالة المستويات النزرة من السيتوكينات ، وتحديدا activin-A ، الذي يعزز تمايز الأديم الباطن ، على حساب تحريض القلب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الثقافة الباردة لأنواع الخلايا الاستقرائية داخل المجموع ، للإجابة على أسئلة أخرى ، مثل كيف تؤثر إشارات paracrine من الأنسجة الجنينية المجاورة على تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في سلالة القلب.