تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام زراعة خلوية مشتركة من نوعين من الخلايا باستخدام إدخالات ذات غشاء قابل للاختراق ، مما يسمح بنشر العوامل القابلة للذوبان المفرزة. يتم تحقيق ذلك من خلال سلسلة من الخطوات التي تضع بدقة إدخالات تحتوي على نوع خلية واحد في صفيحة زراعة الأنسجة متعددة الآبار تحتوي على نوع ثان من الخلية. نبدأ في نوع خلية البذر رقم واحد في الإدخالات ، وبذر نوع الخلية رقم اثنين في لوحة زراعة الأنسجة متعددة الآبار.

الخطوة الثانية هي نقل الإدخالات إلى آبار اللوحة التي تحتوي على نوع الخلية رقم اثنين. في النهاية ، يعطي هذا القدرة على حصاد نوعي الخلايا بالإضافة إلى المواد الطاففية المعنية. لذلك ، من الممكن تقييم تأثير العوامل القابلة للذوبان المفرزة على نوع الخلية ذات الاهتمام.

في الكائنات متعددة الخلايا ، تثير العوامل القابلة للذوبان التي تفرز استجابات من أنواع مختلفة من الخلايا نتيجة لإشارات الباراكرين. على هذا النحو ، تكمن قيمة نظام الزراعة المشتركة في قدرته على تقديم طريقة أصلية لتقييم تغيرات المعلمات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان المفرزة في غياب الاتصال بالخلية الخلوية. توفر أنظمة الاستزراع المشترك المدرجة مزايا مختلفة مقارنة بتقنيات الاستزراع المشترك الأخرى، مثل: واحدة عن طريق الإشارات الاتجاهية. قطبية خلية محفوظة ؛ وثلاثة اكتشاف خاص بالسكان للتغيرات الخلوية.

تفصيل بروتوكول محدد لقياس التأثيرات السامة للسيتوكين الذي يفرزه عديدات السكاريد الدهنية المنشط N9 على خلايا PC12 العصبية ، وبالتالي توفير فهم ملموس لمنهجية الاستزراع المشترك للإدخال. للبدء ، قم بفك غلاف لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا وإدخالات بولي تترافلورو إيثيلين بور 0.4 ميكرون من عبواتها. بعد ذلك ، ضع الإدخالات في الآبار الفارغة للوحة زراعة الأنسجة عن طريق الإمساك بالحافة العلوية للملحق باستخدام ملاقط معقمة.

بعد ذلك ، املأ الإدخالات بوسط N9 الروتيني حتى يتم تغطية الغشاء بالكامل. احتضان الإدخالات لمدة ساعة واحدة على الأقل ، أو طوال الليل ، لتحسين قدرة الخلايا على الالتصاق. بمجرد أن تصبح الإدخالات جاهزة ، قم بتقسيم الخلايا الدبقية الصغيرة N9 عند التقاء 80 إلى 90٪ باستخدام وسط N9 الروتيني للحصول على تعليق الخلية الذي سيتم استخدامه لزرع الإدخالات.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط الروتيني من الإدخالات مع الحرص على عدم ثقب الغشاء بطرف الماصة الدقيقة. بعد ذلك ، قم بزرع كل إدراج عند 60،000 خلية لكل سنتيمتر مربع مع 50 ميكرولتر من تعليق الخلية ، أو وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للإدراج. أثناء توزيع معلق الخلية ، تأكد من أنه يظل متجانسا عن طريق قلب الأنبوب من حين لآخر.

عندما يتم زرع جميع الإدخالات ، قم بهز اللوحة برفق ذهابا وإيابا ، ثم من اليسار إلى اليمين ، من أجل توزيع الخلايا بالتساوي. تجنب القيام بحركات دائرية لأن ذلك سيؤدي إلى تراكم الخلايا في وسط الإدخال بعد ذلك ، قم باحتضان اللوحة التي تحتوي على الإدخالات لمدة 24 ساعة قبل المتابعة مع تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9.

ابدأ بوزن 10 ملليغرام من عديد السكاريد الدهني وقم بتخزينه في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل لاستخدامه لاحقا. نظرا لأن عديدات السكاريد الدهنية هي سم داخلي قوي مؤيد للالتهابات ويتطلب احتياطات أمان خاصة ، يوصى بشدة باستخدام النظارات والقفازات وجهاز التنفس الصناعي للجسيمات. بعد ذلك ، قم بإنشاء مجموعة من التخفيفات التسلسلية لعديدات السكاريد الدهنية باستخدام وسط العلاج N9 الدافئ للحصول على حلول عمل من أربعة واثنين وميكروغرام واحد لكل ملليلتر.

أخيرا ، قم بإزالة نصف وسط الثقافة من الإدخالات ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا. بعد ذلك ، أضف برفق 25 ميكرولترا من محاليل عمل عديدات السكاريد الدهنية إلى الإدخالات للحصول على تخفيفات نهائية من اثنين أو واحد أو 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضن الطبق لمدة 24 ساعة أخرى قبل الشروع في تجارب الزراعة المشتركة.

تتطلب هذه الخطوة خلايا PC12 مطلية ب 30،000 خلية لكل سنتيمتر مربع من الخلايا العصبية الداخلية المتمايزة ، و N9 microglia المنشطة بعديدات السكاريد الدهنية لمدة 24 ساعة كما هو موضح في القسم السابق. ابدأ بإزالة كل الوسيط برفق من الإدخالات ، واستبداله ب 50 ميكرولتر من وسط معالجة N9 الطازج والدافئ. يعد ذلك ضروريا لإزالة جميع آثار عديدات السكاريد الدهنية ، مع ترك الخلايا الدبقية الصغيرة N9 المنشطة فقط.

ضع في اعتبارك أن الإدخالات مفكوكة في آبار لوحة زراعة الأنسجة وقد تتحرك إذا تم الضغط على الطرف بشدة على الحائط. يجب تنفيذ هذه الخطوة بإدخال واحد في كل مرة لمنع الخلايا من الجفاف بسبب التلامس المطول مع الهواء. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط خلية PC12 العصبي تماما واستبدله ب 0.6 مل من وسط علاج PC12 الطازج والدافئ.

افعل ذلك جيدا في كل مرة للتأكد من أن الخلايا لا تجف. باستخدام الملقط ، أمسك الحافة العلوية للملحق وضعها برفق في البئر التي تحتوي على خلايا PC12 العصبية. عندما يتم نقل جميع الإدخالات ، تحقق من وجود فقاعات هواء تحت أغشية الإدخالات.

ستمنع فقاعات الهواء أي تبادل عبر غشاء الملحق ويمكن أن تعرض التجربة بأكملها للخطر. قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق رفع الملحق برفق شديد من البئر باستخدام الملقط ووضعه مرة أخرى في وسط زراعة الخلية ، يجب أن يتخلص هذا الإجراء من معظم الفقاعات. ومع ذلك ، بالنسبة للفقاعات الثابتة ، حاول غمس الملحق برفق مرة أخرى في وسط زراعة الخلية بزاوية.

لا تطرق أو تحرك الإدخالات ، لأن هذا يميل إلى التسبب في تفكك الخلايا الملتصقة. بعد ذلك ، تحقق من أحجام الوسائط في كل من الإدخالات والآبار ، يجب أن يكون السائل في كلا المقصورين على نفس المستوى تقريبا. عندما تتم إزالة جميع فقاعات الهواء ، وتكون أحجام الوسائط مناسبة ، احتضان اللوحة.

يمكن بعد ذلك حصاد الخلايا أو وسط الاستزراع أو كليهما لقياس تأثيرات إشارات paracrine بين الخلايا الدبقية الصغيرة N9 وخلايا PC12 العصبية. تم إجراء فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم على وسط زراعة الخلايا في المقصورة السفلية لتحديد كمية السيتوكينات المسببة للالتهابات. توضح النتائج أنه بعد 24 ساعة من فترة التنشيط ، قامت الخلايا الدبقية الصغيرة N9 المعالجة بميكروغرامين لكل مليلتر من عديد السكاريد الدهني بإفراز المزيد من السيتوكينات المسببة للالتهابات بشكل ملحوظ ، مثل interluken-6 ، وعامل نخر الورم ألفا ، وإنترفيرون جاما ، مقارنة بالخلايا الدبقية الصغيرة التي لم يتم علاجها.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة N9 المعالجة بميكروغرام واحد لكل مليلتر من عديدات السكاريد الدهنية تفرز بشكل ملحوظ المزيد من إنترفيرون جاما بعد 24 ساعة ، بينما استغرق الأمر 48 ساعة لرؤية زيادة كبيرة في مستويات الخلية المتوسطة من interluken-6 وعامل نخر الورم ألفا. في المقابل ، فشلت حالة 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر في تعزيز تعبير السيتوكين في الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في كل من 24 و 48 ساعة بعد فترة التنشيط. علاوة على ذلك ، تشير البيانات في 24 ساعة في مجموعة ميكروغرامين لكل مليلتر إلى وجود داء دبقي صغير ، وهي زيادة في عدد الخلايا الدبقية الصغيرة.

ومع ذلك ، لم يزد العدد الخلوي بشكل كبير إلا بعد 48 ساعة. أخيرا ، من أجل تقييم عواقب تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تؤدي إلى تعزيز إفراز السيتوكين والدبقية الدقيقة ، تم تقييم السمية الخلوية في خلايا PC12 العصبية المزروعة بشكل مشترك. من خلال قياس مستويات نازعة هيدروجين اللاكتات خارج الخلية ، والتي تطلقها الخلايا التالفة ، وجد أن خلايا PC12 العصبية تظهر المزيد من موت الخلايا مع زيادة تركيز عديد السكاريد الدهني على خلايا N9.

على هذا النحو ، تظهر هذه النتائج أن العوامل القابلة للذوبان المفرزة قادرة على عبور غشاء إدخالات الزراعة المشتركة ، ويمكن أن تسبب تلفا ساما للخلايا لخلايا PC12 العصبية في حالة عدم وجود اتصال بين الخلية والخلية. بينما تم تقديم سيناريو واحد فقط لإدراج الثقافة المشتركة هنا ، إلا أنها تقنية مرنة للغاية. في هذا البروتوكول ، تمت معالجة نوع واحد من الخلايا مسبقا بالجزيء المسؤول عن تقليل إفراز العوامل القابلة للذوبان التي تؤثر عند نقل الإدخال إلى البئر على سلوك نوع الخلية الثانية.

ومع ذلك ، من الممكن احتضان كلا النوعين من الخلايا معا في نظام زراعة مشتركة للكشف عن الضعف المتزايد أو المقاومة لأحد مجموعات الخلايا أو كليهما لعلاج لاحق. يمكن لهذه التقنية ببساطة الاستفادة من مجموعتين من الخلايا المحتضنة معا دون أي علاج ، لتقييم الإشارات المتبادلة القاعدية ، على سبيل المثال. بالإضافة إلى تقديرها في مجال الالتهاب العصبي كما هو موضح هنا ، يمكن استخدام أنظمة الزراعة المشتركة للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بتجديد الورم ، أو التهاب الخلايا المبرمج ، أو إشارات موت الخلايا المبرمج ، أو أي موضوع آخر يحتوي على مكون من إشارات الباراكرين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية إدراج أنظمة الثقافة المشتركة يمكن أن تقدم طريقة بسيطة لتقييم التغييرات بوساطة عامل قابل للذوبان المفرز. ونأمل أن نكون قد أقنعتك بالإمكانيات العالية لأنظمة الزراعة المشتركة هذه في دراسة إشارات الباراكرين متعددة الخلايا في غياب الاتصال بين الخلية والخلية.