تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام استنبات مشترك للخلايا يتكون من نوعين من الخلايا باستخدام إدخالات ذات غشاء نفاذ، مما يسمح بانتشار العوامل الذائبة المفرزة. يتم تحقيق ذلك من خلال سلسلة من الخطوات التي تضع بدقة الإدخالات التي تحتوي على نوع واحد من الخلايا في طبق زراعة أنسجة متعدد الفجوات يحتوي على نوع ثانٍ من الخلايا. نبدأ بزراعة النوع الأول من الخلايا في الإدخالات، وزراعة النوع الثاني من الخلايا في طبق زراعة أنسجة متعدد الفجوات.

تتمثل الخطوة الثانية في نقل الرقاقات إلى آبار الطبق الذي يحتوي على النوع الثاني من الخلايا. يتيح ذلك في النهاية القدرة على حصاد نوعي الخلايا بالإضافة إلى السوائل الطافية الخاصة بكل منهما. وبالتالي، يمكن تقييم تأثير العوامل الذائبة المفرزة على نوع الخلايا المستهدف.

في الكائنات متعددة الخلايا، تثير العوامل الذائبة المفرزة استجابات من أنواع مختلفة من الخلايا نتيجةً للتأشير المجاوز (paracrine signalling). وبناءً على ذلك، تكمن قيمة نظام الزراعة المشتركة باستخدام الغشاء المدرج (insert co-culture system) في قدرته على توفير وسيلة مبتكرة لتقييم التغيرات في المعايير الخلوية التي تتوسطها العوامل الذائبة المفرزة في غياب الاتصال المباشر بين الخلايا. وتوفر أنظمة الزراعة المشتركة بالغشاء المدرج مزايا متنوعة مقارنة بتقنيات الزراعة المشتركة الأخرى، مثل: أولاً، التأشير أحادي الاتجاه؛ ثانياً، الحفاظ على القطبية الخلوية؛ وثالثاً، الكشف عن التغيرات الخلوية الخاصة بكل مجموعة سكانية من الخلايا.

سيتم تفصيل بروتوكول محدد لقياس التأثيرات السامة للسيتوكينات التي تفرزها الخلايا الدبقية الصغيرة N9 المنشطة بـ lipopolysaccharide على خلايا PC12 العصبية فيما يلي، مما يوفر فهماً ملموساً لمنهجية الزراعة المشتركة باستخدام الإدراجات (inserts). للبدء، قم بإخراج طبق زراعة الأنسجة المكون من 24 بئراً وإدراجات polytetrafluoroethylene ذات مسام 0.4 micron من عبواتها. بعد ذلك، ضع الإدراجات في الآبار الفارغة لطبق زراعة الأنسجة عن طريق الإمساك بالحافة العلوية للإدراج باستخدام ملاقط معقمة.

بعد ذلك، املأ الرقاقات بوسط N9 الروتيني حتى يتم تغطية الغشاء بالكامل. قم بحضن الرقاقات لمدة ساعة واحدة على الأقل، أو طوال الليل، لتحسين قدرة الخلايا على الالتصاق. وبمجرد أن تصبح الرقاقات جاهزة، قم بفصل خلايا الميكروغليا N9 عند وصولها إلى درجة تلاقي 80 إلى 90% باستخدام وسط N9 الروتيني للحصول على معلق خلوي سيُستخدم لاستزراع الرقاقات.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط الروتيني من الإدراجات مع الحرص على عدم ثقب الغشاء بطرف الماصة الدقيقة. بعد ذلك، قم باستزراع كل إدراج بـ 60,000 خلية لكل سنتيمتر مربع باستخدام 50 µL من معلق الخلايا، أو وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة للإدراجات. وأثناء توزيع معلق الخلايا، تأكد من بقائه متجانساً عن طريق قلب الأنبوب من حين لآخر.

عند الانتهاء من استزراع كافة الإدراجات، قم بهز الطبق بلطف ذهابًا وإيابًا، ثم من اليسار إلى اليمين، وذلك لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ. تجنب القيام بحركات دائرية لأن ذلك سيؤدي إلى تراكم الخلايا في مركز الإدراج. بعد ذلك، قم بحضن الطبق الذي يحتوي على الإدراجات لمدة 24 ساعة قبل المتابعة في تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة N9.

ابدأ بوزن 10 milligrams من lipopolysaccharide واحفظها في أنبوب Eppendorf سعة 1.5 milliliter لاستخدامها لاحقاً. ونظراً لأن lipopolysaccharide هو ذيفان داخلي قوي محفز للالتهابات ويتطلب احتياطات سلامة محددة، يُوصى بشدة بارتداء النظارات والقفازات وجهاز تنفس للجسيمات. بعد ذلك، قم بإجراء سلسلة من التخفيفات المتتالية لـ lipopolysaccharide باستخدام وسط معالجة N9 الدافئ للحصول على محلول عمل بتركيزات أربعة واثنين وواحد micrograms per milliliter.

أخيراً، قم بإزالة نصف وسط الزرع من الأدراج، مع الحرص على عدم تعريض الخلايا للاضطراب. بعد ذلك، أضف بلطف 25 µL من محاليل العمل الخاصة بـ lipopolysaccharide إلى الأدراج للحصول على تخفيفات نهائية تبلغ 2 أو 1 أو 0.5 µg/mL. قم بتحضين الطبق لمدة 24 ساعة أخرى قبل البدء في تجارب الزراعة المشتركة.

تتطلب هذه الخطوة خلايا PC12 موزعة بكثافة 30,000 خلية لكل سنتيمتر مربع من العصبونات البينية المتمايزة، وخلايا N9 الدبقية الصغيرة المنشطة باستخدام lipopolysaccharide لمدة 24 ساعة كما هو موضح في القسم السابق. ابدأ بإزالة جميع أوساط الزرع من الإدراجات برفق، واستبدالها بـ 50 microliters من وسط معالجة N9 الطازج والدافئ. هذا الإجراء ضروري لإزالة جميع آثار lipopolysaccharide، بحيث لا تبقى سوى خلايا N9 الدبقية الصغيرة المنشطة.

ضع في اعتبارك أن الرواسب تكون غير مثبتة في آبار طبق زراعة الأنسجة وقد تتحرك إذا ضُغطت الماصة بقوة زائدة على الجدار. يجب تنفيذ هذه الخطوة لـرواسب واحد في كل مرة لمنع جفاف الخلايا نتيجة التلامس المطول مع الهواء. بعد ذلك، قم بإزالة الوسط الغذائي لخلايا neuronal PC12 تماماً واستبدله بـ 0.6 milliliters من وسط معالجة PC12 الطازج والدافئ.

قم بتنفيذ هذه الخطوة في بئر واحد في كل مرة لضمان عدم جفاف الخلايا. وباستخدام الملاقط، أمسك الحافة العلوية للغشاء المدرج وضعه برفق في البئر الذي يحتوي على خلايا PC12 العصبية. وعند نقل جميع الأغشية المدرجة، تحقق من وجود فقاعات هواء أسفل أغشية هذه المدرجات.

ستمنع الفقاعات الهوائية أي تبادل عبر غشاء القطعة المدرجة (insert) وقد تعرض التجربة بأكملها للخطر. قم بإزالة أي فقاعات هوائية عن طريق رفع القطعة المدرجة برفق شديد من البئر باستخدام الملاقط وإعادتها إلى وسط زراعة الخلايا، ومن شأن هذا الإجراء أن يتخلص من معظم الفقاعات. ومع ذلك، بالنسبة للفقاعات المستعصية، حاول غمس القطعة المدرجة برفق مرة أخرى في وسط زراعة الخلايا بزاوية مائلة.

تجنب نقر أو تحريك الغرسات، لأن ذلك يؤدي إلى تفكك الخلايا الملتصقة. بعد ذلك، تحقق من أحجام الوسط في كل من الغرسات والآبار، حيث يجب أن يكون مستوى السائل في كلا الحجرتين متساويًا تقريبًا. وبمجرد إزالة جميع فقاعات الهواء وضبط أحجام الوسط بشكل مناسب، قم بتحضين الطبق.

يمكن بعد ذلك حصاد الخلايا، أو وسط الزرع، أو كليهما، لقياس تأثيرات التأشير المجاوز للخلايا (paracrine signalling) بين الخلايا الدبقية الصغيرة N9 وخلايا PC12 العصبية. وقد أُجريت مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على وسط الزرع الخلوي في الحجرة السفلية لتقدير كمية السيتوكينات المحرضة للالتهاب. وتوضح النتائج أنه بعد مرور 24 ساعة من فترة التنشيط، أفرزت الخلايا الدبقية الصغيرة N9 المعالجة بـ 2 µg/mL من عديد السكاريد الدهني (lipopolysaccharide) كميات أكبر بكثير من السيتوكينات المحرضة للالتهاب، مثل interleukin-6 وtumor necrosis factor-alpha وinterferon gamma، مقارنة بالخلايا الدبقية الصغيرة التي لم يتم علاجها.

بالإضافة إلى ذلك، أفرزت خلايا الميكروغليا N9 المعالجة بـ 1 µg/mL من ليبوبوليسكريد كمية أكبر بشكل ملحوظ من إنترفيرون غاما بعد 24 ساعة، بينما استغرق الأمر 48 ساعة لملاحظة زيادة ذات دلالة إحصائية في مستويات إنترلوكين-6 وعامل نخر الورم ألفا في الوسط الخلوي. وفي المقابل، فشلت حالة المعالجة بـ 0.5 µg/mL في تعزيز تعبير السيتوكينات في خلايا الميكروغليا N9 بعد 24 و 48 ساعة من فترة التنشيط. علاوة على ذلك، تشير البيانات عند 24 ساعة في مجموعة 2 µg/mL إلى حدوث داء الميكروغليا، وهو زيادة في تعداد الخلايا الميكروغلوية.

ومع ذلك، لم يزدد عدد الخلايا بشكل ملحوظ إلا بعد مرور 48 ساعة. وأخيراً، ومن أجل تقييم تبعات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تؤدي إلى تعزيز إفراز السيتوكينات والدباق الدبقي الصغير، تم تقييم السُمية الخلوية في خلايا PC12 العصبونية التي تمت زراعتها بشكل مشترك. ومن خلال قياس مستويات إنزيم نزع هيدروجين اللاكتات خارج الخلوي، والذي تفرزه الخلايا التالفة، وُجد أن خلايا PC12 العصبونية تظهر زيادة في موت الخلايا مع ارتفاع تركيز lipopolysaccharide على خلايا N9.

وبناءً على ذلك، تُظهر هذه النتائج أن العوامل الذائبة المفرزة قادرة على عبور غشاء حواجز الزراعة المشتركة، ويمكن أن تسبب ضرراً سمياً للخلايا العصبية PC12 في غياب التلامس الخلوي المباشر. وبالرغم من عرض سيناريو واحد فقط للزراعة المشتركة باستخدام الحواجز هنا، إلا أنها تقنية مرنة للغاية. ففي هذا البروتوكول، تمت معالجة نوع واحد من الخلايا مسبقاً بالجزيء المسؤول عن تقليل إفراز العوامل الذائبة التي تؤثر، عند نقل الحاجز إلى البئر، على سلوك النوع الثاني من الخلايا.

ومع ذلك، يمكن تحضين كلا نوعي الخلايا معاً في نظام استزراع مشترك للكشف عن زيادة الضعف، أو المقاومة، في إحدى المجموعتين الخلويتين أو كلتيهما تجاه علاج لاحق. ويمكن لهذه التقنية ببساطة استخدام مجموعتين من الخلايا يتم تحضينهما معاً دون أي علاج، لتقييم الإشارات الباراكرينية المتبادلة الأساسية، على سبيل المثال. وبالإضافة إلى قيمتها في مجال الالتهاب العصبي كما هو موضح هنا، يمكن استخدام أنظمة الاستزراع المشترك للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بتجدد الأورام، أو التهاب الأعصاب، أو إشارات الموت الخلوي المبرمج، أو أي موضوع آخر يتضمن مكوناً من الإشارات الباراكرينية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية توفير أنظمة الزراعة المشتركة باستخدام الإدراجات (insert co-culture systems) طريقة بسيطة لتقييم التغيرات التي تتوسطها العوامل الذائبة المفرزة. ونأمل أن نكون قد أقنعناك بالإمكانات العالية لهذه الأنظمة في دراسة الإشارات الجوارية (paracrine signalling) متعددة الخلايا في غياب الاتصال المباشر بين الخلايا.