3D Flipwell Engineering لتطوير أنظمة غير متزامنة للعلاجات السمية والمناعية في الخلايا البكتيرية والأمعاء والمناعة

طورنا نظام زراعة ثلاثية الأبعاد يحاكي بيئة مخاطية الأمعاء لدراسة التداخل المتسلسل وتقييم استجابات الأدوية التي يمكن استخدامها لفحص الأدوية وفهم التفاعلات الخلوية المخاطية. طورت مجموعات مختلفة عدة أنظمة زراعة مختلفة لنمذجة بيئة مخاطية الأمعاء باستخدام تقنيات هندسة حيوية معقدة جدا. لكن بدلا من ذلك، طورنا نظام الزراعة المشتركة الذي يسهل صنعه باستخدام مواد أقل تكلفة.

كشف نظام الزراعة المشتركة لدينا أن دواء بروتين يحفز استجابات منسقة بين بكتيريا الأمعاء والخلايا الطهارية والمناعة، مما ينشط مناعة المضيف على الأرجح مع مستقلبات البكتيريا لدينا ويتوسط في التواصل بين الأنواع. نهدف إلى دراسة كل من السلالات البكتيرية الهوائية واللاروبية ومستقلباتها لكشف تأثيراتها المعدلة للمناعة، مما يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية مناعية جديدة تعتمد على مستقلبات البكتيريا. للبدء، افتح غطاء صحن بتري وضعه جانبا.

ضع شفرة المشرط على حافة قاع طبق بيتري. خذ مجموعة من الملقط المعقم وامسك الإدخال من قاع الإدخال للأعلى برفق لإزالته من العبوة. باليد الأخرى، خذ شفرة المشرط المعقمة وارفعها إلى الإدخال الداخلي.

بحركة على شكل حرف C، اخترق الغشاء عند الحافة وقم بتحريك شفرة المشرط بلطف حول أسفل الإدخال مع البقاء قريبا من الجدار البلاستيكي. اقطع غشاء PET واستخدم المجموعة الثانية من الملقط لإزالته. ثم استخدم شفرة المشرط لكشط أي بقايا غشاء بيضاء لتنظيف حافة وحافة الإدخال.

بعد ذلك، فرد بلطف قطرة سيليكون بحجم 2-3 ملم حول أسفل الإدخال مع الحرص على عدم لمس الغشاء. التقط المجموعة الثانية من الملقط المعقم وارفع الإدخال الأول بعناية بدون الغشاء خارج حقيبة الحماية. اجمع القطعتين معا من الأسفل إلى الأسفل حتى تصطف الحواف السفلية.

عند لصق طبقة فليبويل، ضعها داخل الحزمة المعقمة الأصلية أو طبق بتري عميق لتجف لمدة 72 ساعة. استخدم غطاء أطباق بتري المحددة لتغطية مجموعة المدخن. لتعقيم مجموعات المدخنة، استخدم ملقط معقم لتعليق مكدس فليبويل على حافة حافة صحن بتري العميق المحدد.

ثم أغلق الوشاح الزجاجي لخزانة السلامة البيولوجية وشغل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لاختبار التسرب قبل طلاء الكولاجين، أضف أولا 500 ميكرولتر من PBS المعقم أو الماء منزوع الأيونات المعقم. في اليوم التالي، استنشق السائل المستخدم للاختبار قبل تجفيف الأكوام لمدة ساعة إلى ساعتين داخل خزانة السلامة البيولوجية.

لتغطية الغشاء بالكولاجين، افتح غطاء طبق بتري ودع فليبويل يتدلى على حافة طبق بيتري. أضف بحذر 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى جانب واحد من المدخنة. استنشق محلول الكولاجين بعد ساعة، ثم استخدم ماصة 200 ميكرولتر من PBS المعقمة بعد استنشاق PBS، غط طبق بتري بغطاء واترك الغشاء يجف لمدة 60 دقيقة داخل الخزانة.

عندما يجف الغشاء، استخدم ملقط معقم أو ملقط واقلب فليبويل إلى الجانب المقابل واتركه يتدلى من حافة طبق بتري. لصنع الإدخال البكتيري، ضع مجموعتين من الملقط المعقم وفتحات 24 بئر داخل خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام الملقط المعقم، ارفع الإدخال من حقيبته المعقمة.

باستخدام المجموعة الثانية من الملقط أو الملقط، اكسر الأرجل البلاستيكية الصغيرة في أسفل الإدخال. اختبر الإدخال ذو 24 البئر عن طريق تركيبه داخل أحد مكدسات الإدخال المعقمة من فليب ويل أو الإدخال الأصلي ذو ال 12 بئرا. لبدء زرع فليبويل، قم بزرع 500 ميكرولتر من خطوط الخلايا الطهارية على كل جانب من الجانب القمي لفليب ويل.

غط التجميعات بغطاء طبق بتري، ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل حتى تلتصق الخلايا. افتح غطاء طبق بتري واسحب وسائط DMEM من الجانب الأعلى لكومة فليبويل. باستخدام الملقط المعقم، التقط فليب ويل بعناية من الخطاف وقم بتدويره بمقدار 180 درجة.

مع المجموعة الثانية من الملقط المعقم، أمسك بكومة فليبويل من الخطاف الآخر الذي أصبح الآن مواجها للأعلى. ثم أنزل المجموعة مرة أخرى إلى طبق بتري الخطاف فوق حافة طبق البتر. أضف 500 ميكرولتر من تعليق خلايا THP-1 إلى الجانب الأعلى من مكدس إدخال الزراعة المشتركة.

قم بضبط وسط HT-29 لخلايا القولون الظهارية بإضافة وسط إلى طبق بترى العميق. لإزالة أي فقاعات هواء، أمسك مكدس فليبويل من الذراع باستخدام ملقط معقم. أنزل إبرة جافاج بحذر داخل وتحت مجموعة الإدخال وضع الطرف الناعم برفق شديد نحو فقاعة الهواء.

اسحب المكبس ببطء وبعناية وراقب فقاعة الهواء تختفي ببطء. ثم أزل الإبرة والحقنة بعناية من فليب ويل. بعد إزالة فقاعات الهواء باستخدام إبرة جافاج، قم بزراعة كلا النوعين من الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا.

باستخدام الملقط، ضع الإدخال داخل طبق بتري معقم وغطه بالغطاء. انقل طبق البتري مع فليبويل إلى خزانة السلامة الحيوية وضعه جانبا على الجانب المقابل من الطبق مع إدخالات بكتيرية. قم بإخراج 300 ميكرولتر من وسط DMEM من الجانب القمي لإدخال البكتيريا، ثم غطه بغطاء صحن بيتري.

الآن، أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من مزرعة Bacillus subtilis إلى البكتيريا ذات ال 24 بئرا وأدخلها في الجانب العلوي من فليبويل. قم بتدوير الذراع وعلقها من حافة مكدس الإدخال المشترك. أمسك الكومة باستخدام المجموعة الثانية من الملقط المعقم.

بعد حضانة لمدة ثلاث ساعات، استخدم ملقط معقم لإزالة الإدخال البكتيري من فليبويل. ضع فليب ويل داخل أنبوب مخروطي بسعة 50 ملليلتر دون الحاجة للتفكيك. لتفكيك فليب ويل للمجهر الإلكتروني، أمسكه بكلتا يديك ولف كل جزء ملصق من المكدسة.

قم بتدوير الإدخال مع الغشاء وضعه على الأرض مع وضع الغشاء للأعلى. أمسك الإدخال بعناية، وقص الغشاء بعناية باستخدام شفرة المشرط، ثم ضعه داخل أنبوب سعة 1.7 ملليلتر يحتوي على محلول ألدهيد بارافورم. بالنسبة للمجهر الكونفوكي، أضف 300 ميكرولتر من PBS المعقم إلى الجانب القمي.

قم بإزالة الرزمة بعناية من طبق بتري بعد إزالة PBS. الآن، اقلب فليب ويل وأضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الجانب المواجه الآن لأعلى RPMI من مكدس إدخال الزراعة المشتركة في فليب ويل، ثم استنشق المحلول الملحي المخزن بالفوسفات. باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر، أنشئ قطرة كبيرة من PBS.

لف مجموعة الإدخال لتنفصل إلى الإدخالات. ثم ضع مكدس فليب ويل مع خلايا THP-1 بعناية فوق قطرة 200 ميكرولتر من PBS. أضف 200 ميكرولتر من محلول نفاذية إلى الجانب العلوي مع خلايا ظهارية القولون واتركها لمدة 10 دقائق.

للصبغ المناعي الفلوري، قم بعمل ماصة بسعة 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي في أعلى الإدخال. أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى بئر صفيحة تحتوي على 12 بئرا، ثم ضع الإدخال داخل البئر فوق القطرة. غط الجسم المضاد جيدا.

أظهرت التلوين زيادات كبيرة في إفراز المخاط في حجرة الظهارة في الأمعاء بعد علاج السيبيابترين، كما يتضح من زيادة بروتين العلامة الظهارية CK20 وبروتين الغدبية MUC2. في زراعة THP-1 الأحادية، زاد علاج السيبابترين بشكل ملحوظ من تعبير علامة البلاعم M1 CD80، بينما خفض معدل مؤشر البلاعم M2 CD163، مما يشير إلى استقطاب M1. كشف المجهر الإلكتروني الماسح عن زيادة في إفراز المخاط من الخلايا الطهارية في الزراعة المشتركة المعالجة بالسمسم.

تم تحفيز معالجة السيبيابتيرين على شكل أشكال البلعم يشبه النمط الظاهري M1 في كل من الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة. أظهرت الخلايا البكتيرية في الزراعة الأحادية المعالجة بالسيبيابترين أسطحا مجعدة تميز تكوين الأغشية الحيوية.