تطوير أكثر حساسية وخصوصية اللونية آجار المتوسطة للكشف عن الضمة نظيرة الحالة للدم وغيره الضمة الأنواع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم حساسية وخصوصية وسط كروموجينيك جديد للقدرة على اكتشاف وعزل Vibrio parahaemolyticus مقارنة بالوسائط التقليدية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأغذية والبيولوجيا الدقيقة البيئية ، مثل ما هو انتشار أنواع الضمة في بيئات الغذاء والحصاد؟ الميزة الرئيسية لإجراءنا هي أنه يمكن استخدام العديد من العزلات البكتيرية ، بما في ذلك وجود مصفوفة غذائية.

قبل زراعة البكتيريا ، قم بالأوتوكلاف كل وسائط الأجار. ثم قم بتبريد الأجار إلى 45 إلى 50 درجة مئوية في حمام مائي. عندما يصبح الأجار جاهزا ، رتب ألواح بتري الفارغة في أكوام من خمسة إلى ستة أطباق.

ثم ، بدءا من قاع المكدس ، اسكب الأجار المنصهر في كل طبق حتى يمتلئ نصفه تقريبا ، واستبدل الأغطية بعد الصب. اترك الأجار يتماسك في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة على الأقل. لإعداد مزارع السلالة الميكروبية ، عندما يكون الأجار جاهزا ، استخدم حلقة تلقيح معقمة لنقل الثقافات إلى ألواح أجار غير الانتقائية المناسبة ، وخطوط البكتيريا في نمط يسمح بمراقبة المستعمرات المعزولة.

عندما يتم طلاء جميع المستعمرات ، احتضن الثقافات رأسا على عقب عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة ، باستثناء أنواع العطيفة ، والتي يجب تحضينها في وعاء مغلق الغطاء يحتوي على كيس غاز لإنتاج بيئة ميكروهيروس. راقب مورفولوجيا المستعمرة في نهاية الحضانة. يجب أن تنتج الثقافات النقية مستعمرات تظهر مورفولوجيا مستعمرة مماثلة.

لتنمية المستعمرات ذات الأهمية على الوسائط الانتقائية والتفاضلية ، انقل بعض المستعمرات المعزولة إلى خمسة ملليلتر من المرق المناسب وأعد احتضان الثقافات عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بربط حلقة من الثقافات الليلية على واحد على الأقل من ثيوسلفات - سترات - صفراوة - أملاح - سكروز ، أو TCBS ، ولوحة أجار واحدة على الأقل لمدة تصل إلى 96 ساعة من الحضانة عند 35 إلى 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، افحص كل من كثافة الثقافة على اللوحة وحجم المستعمرات المعزولة لتحديد النمو الكلي للسلالات ، وتسجيل لون المستعمرات تحت الضوء المحيط أو الأشعة فوق البنفسجية ، حسب الاقتضاء ، وملاحظة أي خصائص مهمة أخرى للمستعمرات.

لإجراء اختبار الاسترداد ، قم بتلقيح المزارع الصغيرة من Vibrio parahaemolyticus في خمسة ملليلتر من مرق الصويا التريبتيك ، مع استكمال اثنين في المائة من كلوريد الصوديوم ، أو TSBS ، ووضع الأنابيب عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتدوير الثقافات الليلية وقم بإعداد واحد في 10 إلى سالب واحد ، إلى واحد في 10 إلى السالب سبعة تخفيفات للبكتيريا في PBS. باستخدام واحد في 10 أس سالب أربعة إلى واحد في 10 إلى سالب سبعة تخفيفات ، قم بوضع 100 ميكرولتر بالتساوي من كل تخفيف على أطباق فولوغرافية كروموجينية فردية ، TCBS ، وأجار الصويا التربتيك مكمل باثنين بالمائة من أجار كلوريد الصوديوم ، أو TSAS.

احتضن جميع الألواح عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 96 ساعة. ثم عد المستعمرات ، متجاهلا الصفائح التي تحمل مستعمرات كثيرة جدا بحيث لا يمكن عدها أو تحتوي على أقل من 25 مستعمرة. لإجراء فحص المنافسة ، حدد سلالة V.Parahaemolyticus التي تنتج مستعمرات التركواز المتوقعة على TCBS والمستعمرات السماوية على أجار اللوني ، وغير V.

أنواع Parahaemolytius التي لا تنمو على أي من الوسائط أو تظهر لون مستعمرة مختلف. انقل عدد قليل من مستعمرات V.Parahaemolyticus و V.Metschnikovii المعزولة من زراعة TSAS ، إلى خمسة ملليلتر من TSBS لمدة 16 إلى 24 ساعة حضانة عند 35 إلى 37 درجة مئوية. انقل عدد قليل من مستعمرات شيغيلا سوني المعزولة من تسريب قلب الدماغ ، أو BHI ، أجار إلى خمسة ملليلتر من مرق BHI لمدة 16 إلى 24 ساعة عند 35 إلى 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإجراء تخفيف تسلسلي لكل سلالة ، وطلاء التخفيفات على ألواح أجار غير انتقائية لتحديد وحدات تكوين المستعمرة لكل مليلتر من المزارع الليلية. بعد ذلك ، استخدم الثقافات الليلية وأنابيب التخفيف لخلط أحجام مختلفة من سلالة V.Parahaemolyticus وغير V. أنواع Parahaemolyticus ونشر 100 ميكرولتر من الخليط البكتيري على ألواح أجار كروموجينيك فردية و TCBS و TSAS.

بعد ما يصل إلى 96 ساعة عند 35 إلى 37 درجة مئوية ، احسب المستعمرات بناء على اختلافاتها في النمو والتشكل على ألواح اللونية و TCBS. لتقييم آثار متجانسات المحار على نمو البكتيريا على الوسائط الانتقائية والتفاضلية ، قم أولا بوزن 50 جراما على الأقل من لحم المحار من ما لا يقل عن 12 سمكة صدف رخويات ، بما في ذلك اللحوم والمشروبات الكحولية. ثم أضف كتلة متساوية من PBS إلى أنسجة المحار واخلط الخليط بسرعة عالية لمدة 90 ثانية.

بعد ذلك ، أضف 100 جرام من محار المحار المخفف إلى 400 جرام من PBS واخلط الخليط بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة. ثم الأوتوكلاف المتجانس. بعد التبريد ، أضف 100 ميكرولتر من كل V.Parahaemolyticus بين عشية وضحاها وغير V.

استزراع Parahaemolyticus إلى ملاط المحار ، واستخدام الخالط لخلط الخلايا البكتيرية مع متجانس المحار. اجعل واحدا في 10 أس سالب واحدا إلى واحد في 10 أس التخفيفات الثلاثة السالبة لمجانس المحار المسنن في PBS كما هو موضح ، ونشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح كروموجينيكية فردية و TCBS و TSAS. بعد 96 ساعة عند 35 إلى 37 درجة مئوية ، قارن عدد المستعمرات الفعلي على الكروموجينيك و TCBS agars مع عدد المستعمرات المتوقع المستنبط من عدد الألواح القياسي الذي تم إجراؤه على المزارع الليلية.

لتحديد مورفولوجيا النمو والمستعمرة للسلالات المستخدمة في هذه الدراسة ، نمت البكتيريا على وسائط انتقائية وتفاضلية. TCBS هو الوسيط التقليدي المستخدم لعزل بعض أنواع Vibrio ، بما في ذلك V.Parahaemolyticus الفيروزي و V.Cholerae الأصفر. يؤدي استخدام الوسط اللوني لاختيار أنواع Vibrio ذات الصلة سريريا من العينات الغذائية والبيئية إلى توليد السماوي V.Parahaemolyticus والأرجواني V.Cholerae.

لوحظت مستعمرات V.Parahaemolyticus المزروعة على ألواح أجار كروموجينيك في وجود متجانس المحار بأعداد مماثلة لتلك الموجودة على الوسائط غير الانتقائية ، مما يشير إلى أن حد الكشف عن الوسط اللوني مشابه لحد الوسائط غير الانتقائية ، حتى في وجود مصفوفة غذائية. كما أن نمو وتعافي V.Parahaemolyticus لا يتأثر بوجود غير V. أنواع Parahaemolyticus ، وهي سمة أساسية للوسائط التفاضلية والانتقائية ، حيث تحتوي العينات البيئية على أنواع مختلفة من الضمة بأعداد كبيرة ، خاصة بعد إجراء التخصيب.

علاوة على ذلك ، تكشف مقارنة TCBS و agars اللوني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للهيموليسين الحراري عن حساسية وخصوصية أعلى لأجار اللوني ، مما يشير إلى أداء أفضل بشكل عام لهذا الوسط التفاضلي والانتقائي للكشف عن V.Parahaemolyticus وتحديده. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال الإجراء بأكمله بما في ذلك أوقات الاختبار والحضانة لما يقرب من 50 سلالة في غضون 30 يوما عند إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسمية جميع الثقافات بجد واستخدام تقنية التعقيم في جميع الأوقات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ، هل تحمل هذه العزلة المحددة جين ضراوة؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سلامة الأغذية والصحة العامة لاستكشاف اكتشاف أنواع الضمة في المحار وبيئة مصبات الأنهار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عد الألواح القياسي وكيفية تقييم الحساسية والنوعية وحد الكشف لوسط النمو.

لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض والوسط الساخن يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الملابس الواقية ، وتغطية أي جروح مفتوحة ، وفصل النفايات الخطرة بيولوجيا أثناء تنفيذ هذا الإجراء.