الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف بسرعة عن وجود بكتيريا معينة مثل الإشريكية القولونية باستخدام أنفلونزا جينيك جديد ، الحمض النووي ، مجسات Zyme أولا ، الحمض النووي الجيني الكامل. يتم إنشاء مجسات Zyme عن طريق الربط. ثم يتم استزراع البكتيريا لإثراء عدد الجزيئات المستهدفة ويتم تحضير الخليط المتراكم خارج الخلية من المادة الطافية.

ثم يتم دمج الخليط الخام خارج الخلية مع تفاعل مسبار زيم الحمض النووي بين مسبار DNA Zyme والجزيئات المستهدفة ينتج عنه انقسام المسبار ، والذي يستخدمه بعد ذلك التأليق. ينظر إلى تفاعل مقياس الفلور بين المسبار والهدف على أنه زيادة في التألق النسبي. ثم يتم التحقق من النتائج باستخدام تحليل الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الأجسام المضادة هي أن الإجراء أبسط وأسهل في التنفيذ. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تطويرها باستخدام البكتيريا القولونية النموذجية ، إلا أنه يمكن تطبيقها للكشف عن أي مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى المنقولة بالغذاء أو المستشفيات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم قد لا يعتادون على التعامل مع مجسات الحمض النووي الاصطناعي والبكتيريا يوضح الإجراء سيرجيو أغواير ، مساعد باحث من مختبري ومونسو علي ، زميل ما بعد الدكتوراه لهذا البروتوكول.

R-F-D-E-C واحد هو DNA Zyme المميز. وهو يتألف من التسلسل التحفيزي EC واحد مستر باللون الأسود وتسلسل الركيزة FS واحد المسطر باللون الأخضر الموجود داخل الركيزة عبارة عن ارتباط RNA يشار إليه باللون الأزرق r محاط بفلور المسمى DT المشار إليه بواسطة F و QUENCHER المسمى DT المشار إليه بقائمة الانتظار RF SS واحد هو نسخة مشوشة من RFD EEC واحد حيث يتم خلط التسلسل التحفيزي EEC واحد جزئيا إلى SS واحد ، لكن جزء واحد من FS يبقى دون تغيير. يتم تصنيع RF DEC واحد و RF SS واحد عن طريق ربط إنزيمي بوساطة القالب لقليل النوكليوتيدات FS واحد مع قليل النوكليوتيد EC واحد أو SS واحد في وجود LT واحد كقالب ربط لإعداد مخاليط خام خارج الخلية أو CEMS التي سيتم استخدامها كهدف ل R-F-D-E-C يبدأ بتوزيع ملليلترين من LB في أنابيب استزراع معقمة سعة 14 مليلتر باستخدام مسدس ماصة.

بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية من صفيحة المثقاب وقم بإسقاطها في أنبوب مزرعة يحتوي على رطل. ضع الأنابيب في حاضنة مثبتة على درجة حرارة 37 درجة مئوية ورجها عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة بعد الحضانة. لتوليد ثقافة إعادة التلقيح بنسبة 1٪ ، قم بتوزيع ملليلترين من LB الطازج في أنابيب استزراع سعة 14 مليلتر وأضف 20 ميكرولترا من الثقافة البكتيرية من الخطوة السابقة.

احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصل كل محلول بكتيري إلى OD 600 من نقل واحد تقريبا. مليلتر واحد من كل ثقافة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 11 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، انقل المادة الطافية الصافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.

قم بتخزين المادة الطافية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. إذا لم يتم استخدامه على الفور لتحديد ما إذا كانت إشارة الفلورسنت قد تم إنشاؤها مع تفاعل إنزيمات الحمض النووي مع مستخلص الخلايا الخام ، فحص العينات بواسطة القياس الضوئي للأطياف. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي الفلوري وقم بإعداد معلمات الحصول على البيانات مع الإثارة عند 488 نانومتر والانبعاث عند 520 نانومتر.

قم أيضا بإعداد الأداة لأخذ قراءات كل دقيقة لمدة ساعة واحدة. اغسل ثلاثة أكواط من كريستال الكوارتز أولا بالماء المقطر منزوع الأيونات ثم بالإيثانول بنسبة 100٪. جفف الكوفيت عن طريق وميض غاز النيتروجين.

قم بتسمية الكوفيت على أنها C ، واحدة للتحكم ، واحدة ، C ، اثنان للتحكم الثاني و T للاختبار ، انقل 24 ميكرولترا من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى C واحد و 24 ميكرولترا من خليط خارج الخلية الخام المحضر إلى C two و T.أضف 25 ميكرولترا من اثنين X RB إلى كل طبيب بيطري Q وضعهما في مقياس الطيف الضوئي الفلوري. ابدأ في جمع بيانات التألق بعد خمس دقائق ، وأضف ميكرولتر واحدا من خمسة ميكرومولار RFS S واحد إلى C اثنين وميكرولتر واحد من خمسة ميكرومولار ، RFD eec واحد إلى T و C واحد لضمان عدم مقاطعة قراءات التألق. امزج كل محلول عن طريق سحب العينة ، ثم اترك التفاعل يستمر للفترة المتبقية من فترة الاستحواذ.

احفظ البيانات بتنسيق ملف Excel. ثم انقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي واستخدم Excel لإنشاء صورة رسومية. نفس مخاليط التفاعل التي تم استخدامها للتحليل بواسطة Spectra.

يمكن استخدام القياس الضوئي للتحليل عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي. بعد ساعة واحدة من الاستحواذ. قم بإزالة الكوفيتات من مقياس الطيف الضوئي وانقل المحاليل إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة.

قم بإخماد التفاعلات بإضافة خمسة ميكرولترات من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية و 125 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. امزج كل محلول عن طريق الدوامة وضع الأنابيب في فريزر تحت الصفر 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بعد جهاز الطرد المركزي للحضانة. يخاليط التفاعل عند 11 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ويزيل المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينات.

جفف الكريات باستخدام مكثف الحمض النووي لمدة 10 دقائق. أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل الجل والدوامة لفترة وجيزة. قم بالدوران لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة.

بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من عينات التفاعل لكل بئر من 10٪ هلام Dage بعد التشغيل. قم بإزالة الألواح الزجاجية واغسلها جيدا بماء الصنبور. لإزالة أي قطع جل ، امسح الأطباق بمنديل كيم.

امسح لوحة الجل بحثا عن التألق باستخدام ماسح ضوئي للإعصار. قم بتحليل الصور الناتجة باستخدام برنامج قياس كمية الصورة لتقييم حساسية النظام. تزرع الثقافات المخففة بشكل متسلسل لفترات زمنية متزايدة.

لتحديد الحد الأدنى لفترة الحضانة المطلوبة للكشف عن بكتيريا واحدة ، قم بإعداد 10 أنابيب استزراع تحتوي على ملليلترين من رطل ، وتلقيح كل مزرعة ب 100 ميكرولتر من اثنين من CFU لكل مليلتر من مخزون الجلسرين من الإشريكية القولونية واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة في 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة. احصد 300 ميكرولتر من كل أنبوب من أنابيب الاستزراع الملقحة حيث قد لا تكون هناك بكتيريا يمكن اكتشافها للعينات التي يتم حصادها في الوقت المناسب. النقاط 4 8 12.

اسمح للثقافة المتبقية بالنمو لمدة 24 ساعة من أجل تحديد المزارع التي تحتوي على بكتيريا. قم بقياس OD 600 وترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 11 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. انقل المادة الطافية التي تحتوي على CEMS إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل، وخزنها على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام في اليوم التالي.

افحص الثقافات بحثا عن النمو. قد تحتوي واحدة أو اثنتين فقط من الثقافات العشر على الإشريكية القولونية بعد التلقيح ولن تحتوي الأنابيب المتبقية على أي خلايا. استخدم CEMS المستردة من الثقافات الإيجابية في النقاط الزمنية المحددة لإعداد تفاعلات الانقسام باستخدام RFD EEC واحد ، قم بتحليل مخاليط التفاعل باستخدام الرحلان الكهربائي لجل DAGE كما هو موضح سابقا ، تم تحضير كل من مجسات RFD EEC one و RF SS one عن طريق الربط الأنزيمي لأجزاء زيم الحمض النووي إلى الركيزة.

FS واحد من CEM EEC و RFD EEC واحد أو RF SS واحد ثم تم تقييم بواسطة قياس الطيف. كما يتضح هنا. أنتج R-F-D-E-C مستوى عال من إشارة الفلورسنت عند إضافة CEM ec.

في تناقض صارخ ، لم ينتج R FS S واحد إشارة فلورية قوية. وبالتالي فإن وظيفة إنتاج التألق من RFD EEC واحد. عند الاتصال ب CEM EC يتم تسلسله.

خاص للتحقق من أن الزيادات الملحوظة في التألق كانت بسبب انقسام ارتباط الحمض النووي الريبي. تم تحليل مخاليط التفاعل عن طريق الانقسام الداجي ل RFD eec ، ومن المتوقع أن يولد هيدروكسيد الصوديوم واحد في 0.25 مولار شظايا NA ثنائية الأبعاد ، وجزء خماسي أولي يحتفظ بالفلور وجزء ثلاثي الأعداد الأولية يحتفظ بالتبريد. كما يتضح هنا.

أنتج خليط تفاعل RFD EEC CEM EEC بالفعل ناتج الانقسام المتوقع. علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف الجزء المكون من الخمسة أولي فقط من قبل UNC الذي شق R-F-D-E-C والجزء المكون من خمسة أوليات عن طريق التصوير الفلوري. لفحص خصوصية RFD EEC ، تم إجراء فحوصات مضان واحدة باستخدام CEMS التي تم جمعها من العديد من البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام الأخرى فقط.

أنتجت العينة المحتوية على CEM EC زيادة في التألق. يشير عدم وجود تفاعل متقاطع مع CEMS من البكتيريا الأخرى إلى أن R-F-D-E-C واحد انتقائي للغاية للقولونية الإلكترونية لتحديد الحد الأدنى لوقت الزراعة المطلوب للكشف عن خلية بكقولونية واحدة مخففة إلى CFU واحد لكل مليلتر في 100 ميكرولتر مزروع بوسط نمو لمدة 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة. تم تقييم CEMS الناتج الممزوج ب R-F-D-E-C واحد والانقسام بواسطة DAGE كما هو موضح هنا.

صورة لمقايسة Dage إلى أن R-F-D-E-C لم ينتج منتج الانقسام المتوقع. عندما كان رد فعلها مع CEM. تم جمع ECS في أربع وثماني ساعات من النمو مما يشير إلى أن وقت الاستزراع لمدة 12 ساعة مطلوب بمجرد إتقانه.

المكون الرئيسي لهذه التقنية هو الفحص القائم على إنزيم DA يمكن إجراؤه في 60 دقيقة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح بعد هذا التطور. مهد الإجراء الطريق للباحثين في مجال التحليل الحيوي لاستكشاف إنزيمات الحمض النووي الخيفي للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية.