قابلية التصوير خلية على السقالات غير شفافة - استخدام مثال على رواية محبوك التيتانيوم زراعة الاسنان

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور البنية الدقيقة لغرسة نواة التيتانيوم المحبوكة غير الشفافة والتصاق الخلية بها ، باستخدام تقنيات التصوير الفلوري. تعمل هذه الطريقة على تطوير تحليل هندسة الأنسجة باستخدام سقالات غير شفافة. تتمثل إحدى ميزات هذه التقنية في أنه يمكن للمرء تتبع صلاحية الخلية بالإضافة إلى الانتشار على السقالة بثقافة محددة في الهواء.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن تلطيخ الفلورسنت ، وبعد ذلك ، التصور يمثل تحديا. قد تؤثر خصائص السقالة الفردية مثل حجم المسام على التوقيت ، و / أو قد يؤثر تألق السقالة على اختيار الفلوروفورات التي تستخدمها. ضع ما يصل إلى خمس سقالات بسمك ستة أو سبعة ملليمترات في أنبوب سعة 50 مليلتر ، واغسلها بالماء ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة لكل غسلة.

افعل ذلك في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف. بعد ذلك ، اغسل السقالات في 30 مل من محلول Triton X-100 1٪ في نفس الظروف. ثم قم بإجراء غسلتين أخريين بالماء.

الآن ، بالتتابع صوتنة السقالات في درجة الكاشف 99٪ الأسيتون ، 99٪ الأيزوبروبانول ، و 99٪ الإيثانول. أداء كل خطوة صوتنة مرتين لمدة خمس دقائق لكل صوتنة. بعد ذلك ، صوتنة السقالة ثلاث مرات أخرى في الماء لمدة 15 دقيقة.

انتهي بوضع السقالات على منديل خال من النسالة وتجفيفها بالهواء طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتعقيم السقالات لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة. للتأكد من أن التنظيف نجح ، استخدم التألق غير المباشر.

قم بتحميل بئر واحد من لوح 12 بئرا ب 2000 ميكرولتر من محلول تلطيخ الكبريت والرودامين B الطازج ، وباستخدام الملقط ، انقل السقالة إلى تلك البئر. بعد ذلك ، التقط صورا سلبية للسقالة باستخدام مجهر مضان مزود بمجموعة مرشح مكعب RFP LED وابحث عن الشوائب بتكبير عالي. باستخدام خزانة السلامة الحيوية ، انقل السقالات النظيفة إلى آبار لوحة 24 بئر.

أضف 500 ميكرولتر من وسط الثقافة 37 درجة مئوية إلى كل بئر ، واترك السقالة تنقع لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد 500،000 خلية SEP1 مصابة ب Ad-GFP لكل 1 مليلتر من المتوسط. بعد 15 دقيقة ، قم بشفط الوسط تماما من السقالات ، وقم بتثبيتها مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.

ثم احتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة القصيرة ، أضف 500 ميكرولتر إضافي من وسط الاستزراع ، واحتضن السقالات لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتغيير وسط الثقافة لإزالة الخلايا غير الملتصقة.

بعد ذلك ، قم بتقييم التصاق الخلايا وانتشارها على السقالات ، باستخدام مجهر مضان مزود بمجموعة مرشح مكعب GFP LED. للحصول على تلطيخ حي ، قم أولا بوضع خلايا SEP1 على السقالة كما كان من قبل. بعد 24 إلى 48 ساعة ، قم بشفط وسط الثقافة بالكامل واغسل السقالات باستخدام DPBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

الآن ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام وسط الثقافة الذي يحتوي على Calcein AM و Hoechst 33342 و Ethidium homodimer. هذه الفلوروفورات الثلاثة كلها حساسة للضوء ، لذلك من الضروري إبقاء الخلايا في الظلام تمضي قدما. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام الفلوروفورات للحصول على توزيع متساو في جميع أنحاء السقالة.

ستؤثر خصائص السقالة المحددة على وقت الحضانة هذا. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS باستخدام مليلتر واحد لكل بئر. نفذ كل غسلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

مباشرة بعد الغسيل ، قم بتوثيق السقالات باستخدام المجهر الفلوري. لقياس صلاحية الخلية بمرور الوقت ، استخدم قياسات تحويل الريزازورين. أولا ، قم بشفط وسط الاستزراع بالكامل من خلايا SEP1 الموجودة في صفيحة 24 بئر واغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من DPBS لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بتغطية الخلايا بالحجم المطلوب من محلول عمل الريزازورين المعقم وقم بتضمين بئر واحد يحتوي على ريزازورين فقط. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. بعد الحضانة ، انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية المكيفة من كل بئر إلى صفيحة 96 بئر صغيرة لقياس تألقها كما هو موضح في بروتوكول النص.

لمزيد من الزراعة ، قم بإزالة الريزازورين من البئر ، واغسله ثلاث مرات بمليلتر واحد من DPBS. قم بإجراء كل غسلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثالث ، أضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة إلى كل بئر من الخلايا ، واستمر في حضانة هذه الحشرات لمزيد من قياسات المسار الزمني.

باستخدام تلطيخ الفلورسنت غير المباشر ، تم توثيق شوائب التنظيف المسبق لتحسين بروتوكول التنظيف. يظهر الانخفاض الكبير في حمل المادة على السقالة كفاءة بروتوكول التنظيف الموصوف. يتم تحديد الغرسات المتتالية المستخدمة في علاج تقويم المفاصل من خلال الأحداث التي تحدث في واجهة مادة الخلية.

بعد 24 ساعة من الالتصاق بالسقالات ، تم إرفاق خلايا SEP1. ثم تم تطبيق الفلوروفورات لفحص موت الخلايا وتكاثرها على مدى فترة زمنية على السقالات. أظهر تلطيخ الميت الحي تلطيخا نوويا أزرق مع مضان أحمر في الخلايا الميتة ومضان أخضر في خلايا قابلة للحياة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس صلاحية الخلية على السقالة باستخدام مقايسة تحويل الريزازورين. على مدار أسبوعين ، تم جمع البيانات عن الخلايا المزروعة بالسقالات أو بدونها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضبط الفلوروفورات التي تستخدمها على السقالة والمجهر المتاح لديك.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى ، مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي ، من أجل تصور وجود البروتينات ، أو تنشيط شلالات الإشارات. يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج تقويم المفاصل لأن تفاعل وجه الخلية مع الأنسجة المحيطة في الجسم الحي سيحدد وظيفتها ومتانتها.