دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها في الموقع القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور وقياس تفاعلات الميتوكوندريا الشبكية الإندوبلازمية باستخدام مقايسة ربط القرب في الموقع في الخلايا الثابتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي الحيوي لتحليل تفاعلات الميتوكوندريا ER بشكل أفضل في الخلايا الثابتة باستخدام تقنية التألق المناعي البسيطة. نأمل أن أقترح استراتيجيات علاج جديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تصور وقياس تفاعلات الميتوكوندريا ER في الخلايا الثابتة ويمكن تطبيق هذه التقنية على خزعات الأنسجة المدمجة في البارافين للمرضى. باستخدام مقايسة ربط القرب في الموقع الموضح في هذا الفيديو ، يتحد الجسم المضاد الأساسي للفأر الموجه ضد VDAC1 في غشاء الميتوكوندريا الخارجي والجسم المضاد الأولي للأرانب الموجه ضد IP3R1 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية مع حواتمها بالقرب من واجهة الغشاء المرتبطة بالميتوكوندريا. تتم إضافة مجسات ربط القرب التي تحتوي على ذيول نهاية الحمض النووي المرفقة والتي يتم توجيهها ضد IgG للفأر والأرانب ويمكن أن تشكل قوالب لربط oligos الموصل ويمكن تضخيمها وتصورها باستخدام Texas Red Oligonucleotides.يمكن أن يحدث هذا فقط إذا كان البروتينان المستهدفان على مسافة أقل من 40 نانومتر. بالاتفاق مع المسافة بين كلا الغشاءين العضضيين ، في واجهة الغشاء المرتبطة بالميتوكوندريا. لإصلاح الخلايا وحظرها لمقايسة ربط القرب في الموقع ، قم بلوحة خلايا H7 البشرية في 150،000 خلية لكل طبق سفلي زجاجي غير مشفر مقاس 35 مم. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط المزرعة واستخدم 1 مل من PBS لغسل الخلايا. ثم استنشق المخزن المؤقت وأضف 1 مل من عشرة بالمائة من الفورمالديهايد. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا. لإيقاف التفاعل ، أضف 1 مل من 1 M جلايسين واخلط الصفائح بالتناوب. قم بإزالة محلول الجلايسين وأضف 1 مل من 1XPBS. ثم قم بتحريك الألواح لفترة وجيزة واستنشاق المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 100 ملي جلايسين إلى الخلايا. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لمدة 15 دقيقة. بعد شفط المحلول ، قم باختراق الخلايا بإضافة 1 مل من 0.1٪ triton-X100 في PBS. وكرر الحضانة. استنشق المنظف وأضف 1 مل من PBS لغسل الخلايا. بعد إزالة المخزن المؤقت ، أضف 40 ميكرولترا من محلول الحجب إلى كل طبق من الخلايا واحتضان العينات في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اضغط على محلول الحظر من الأطباق ، محاولا الحصول على أحجام متبقية متساوية من المخزن المؤقت لكل شريحة مع عدم السماح للشرائح بالجفاف. لإجراء مقايسة ربط القرب ، استخدم PBS لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. دوامة وإضافة الحل إلى الأطباق. احتضان العينات في 4