دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها في الموقع القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة
ديسمبر 10, 2016
هنا، نحن تصف الإجراء لتصور وقياس مع حساسية عالية التفاعلات الذاتية بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الثابتة. يتميز البروتوكول والأمثل في الموقع قرب ربط فحص استهداف إينوزيتول 1،4،5-ثلاثي مستقبلات / التنظيم الجلوكوز البروتين 75 / قناة أنيون / cyclophilin مجمع تعتمد على الجهد D في واجهة غشاء المرتبطة الميتوكوندريا.
الهدف العام من هذه التجربة هو تصور وقياس تفاعلات الميتوكوندريا الشبكية الإندوبلازمية باستخدام مقايسة ربط القرب في الموقع في الخلايا الثابتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي الحيوي لتحليل تفاعلات الميتوكوندريا ER بشكل أفضل في الخلايا الثابتة باستخدام تقنية التألق المناعي البسيطة. نأمل أن أقترح استراتيجيات علاج جديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تصور وقياس تفاعلات الميتوكوندريا ER في الخلايا الثابتة ويمكن تطبيق هذه التقنية على خزعات الأنسجة المدمجة في البارافين للمرضى. باستخدام مقايسة ربط القرب في الموقع الموضح في هذا الفيديو ، يتحد الجسم المضاد الأساسي للفأر الموجه ضد VDAC1 في غشاء الميتوكوندريا الخارجي والجسم المضاد الأولي للأرانب الموجه ضد IP3R1 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية مع حواتمها بالقرب من واجهة الغشاء المرتبطة بالميتوكوندريا. تتم إضافة مجسات ربط القرب التي تحتوي على ذيول نهاية الحمض النووي المرفقة والتي يتم توجيهها ضد IgG للفأر والأرانب ويمكن أن تشكل قوالب لربط oligos الموصل ويمكن تضخيمها وتصورها باستخدام Texas Red Oligonucleotides.يمكن أن يحدث هذا فقط إذا كان البروتينان المستهدفان على مسافة أقل من 40 نانومتر. بالاتفاق مع المسافة بين كلا الغشاءين العضضيين ، في واجهة الغشاء المرتبطة بالميتوكوندريا. لإصلاح الخلايا وحظرها لمقايسة ربط القرب في الموقع ، قم بلوحة خلايا H7 البشرية في 150،000 خلية لكل طبق سفلي زجاجي غير مشفر مقاس 35 مم. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط المزرعة واستخدم 1 مل من PBS لغسل الخلايا. ثم استنشق المخزن المؤقت وأضف 1 مل من عشرة بالمائة من الفورمالديهايد. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا. لإيقاف التفاعل ، أضف 1 مل من 1 M جلايسين واخلط الصفائح بالتناوب. قم بإزالة محلول الجلايسين وأضف 1 مل من 1XPBS. ثم قم بتحريك الألواح لفترة وجيزة واستنشاق المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 100 ملي جلايسين إلى الخلايا. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لمدة 15 دقيقة. بعد شفط المحلول ، قم باختراق الخلايا بإضافة 1 مل من 0.1٪ triton-X100 في PBS. وكرر الحضانة. استنشق المنظف وأضف 1 مل من PBS لغسل الخلايا. بعد إزالة المخزن المؤقت ، أضف 40 ميكرولترا من محلول الحجب إلى كل طبق من الخلايا واحتضان العينات في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اضغط على محلول الحظر من الأطباق ، محاولا الحصول على أحجام متبقية متساوية من المخزن المؤقت لكل شريحة مع عدم السماح للشرائح بالجفاف. لإجراء مقايسة ربط القرب ، استخدم PBS لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. دوامة وإضافة الحل إلى الأطباق. احتضان العينات في 4
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة إجراءً لتصوير وقياس التفاعلات بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا المثبتة بحساسية عالية. وتعتمد هذه الطريقة على مقايسة ربط التقارب في الموقع المُحسَّنة لاستهداف معقدات بروتينية محددة عند الواجهة الغشائية المرتبطة بالميتوكوندريا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
خلفية علمية
- تلعب الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا أدواراً حاسمة في التمثيل الغذائي الخلوي.
- يعد فهم التفاعلات بينهما أمراً أساسياً لتوضيح الوظائف الخلوية.
- توفر مقايسات الربط القريب طريقة حساسة لدراسة التفاعلات البروتينية.
- تركز هذه الدراسة على معقد بروتيني محدد مشارك في هذه التفاعلات.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتصوير التفاعلات بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا.
- قياس هذه التفاعلات كمياً بحساسية عالية.
- تعزيز فهم عملية التمثيل الغذائي الخلوي ونقل الإشارات.
الطرق المستخدمة
- مقايسة الربط التقاربي في الموضع الأصلي (In situ proximity ligation assay)
- استهداف مستقبل إينوزيتول 1,4,5-تريس فوسفات
- دور البروتين 75 المنظم للجلوكوز
- تحليل معقد قناة الأنيون المعتمدة على الجهد وسيكلوفيلين D
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للتفاعلات بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكندريا.
- القياس الكمي للمعقدات البروتينية عند الواجهة الغشائية.
- إثبات الحساسية العالية في الكشف عن التفاعلات.
الاستنتاجات
- يتيح البروتوكول المطور إجراء دراسة تفصيلية للتفاعلات الخلوية.
- يمكن أن تساهم الرؤى المكتسبة في فهم العمليات الأيضية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في مجالات بحث بيولوجية متنوعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يعد التقدير الكمي للتفاعلات الداخلية بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا أمراً بالغ الأهمية لتقليل المخاطر المرتبطة بفرضيات الاكتشاف المبكر المتعلقة بالإشارات الخلوية والتنظيم الأيضي. يتيح مقايسة الربط التقاربي في الموقع الكشف الحساس والمتعدد عن مواقع اتصال العضيات دون الحاجة إلى الإفراط في تعبير البروتين، مما يعزز الثقة التنبؤية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض. وتعزز هذه القدرة من عملية اتخاذ القرارات المتعلقة بمجموعة المشاريع عند تقاطع التحقق من الهدف وتحليل المسار الميكانيكي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح التصور المباشر والتقدير الكمي لنقاط الاتصال بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا على المستوى الجزيئي.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال تأكيد تقارب البروتينات الداخلية في الخلايا المثبتة والخزعات النسيجية.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف للمسارات التي تشتمل على إشارات الكالسيوم والتفاعل المتبادل بين العضيات.
- يعزز الثقة التنبؤية في تطوير الأهداف المرتبطة بالاضطرابات الأيضية والاضطرابات الإشارية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مقايسة قياسية وقابلة للتكرار لتقدير التفاعلات البروتينية-البروتينية بدقة تصل إلى مستوى العضيات الفرعية.
- يتيح الاختبار تحت ظروف متعددة لتقييم تأثير المركبات أو الاضطرابات الجينية على نقاط التماس بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا.
- يقدم مخرجات كمية مناسبة للتحليل المقارن عبر المجموعات التجريبية المختلفة.
- يدعم قابلية توسيع المقايسة وإعادة استخدام المنصة لمبادرات فحص أوسع نطاقاً.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال تمكين التحليل في خزعات الأنسجة المشتقة من المرضى.
- يحافظ على الاستمرارية الترجمية بدءاً من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من أهداف التفاعل بين العضيات.
- يدعم التقدم المدروس للمخاطر من خلال تقديم أدلة ميكانيكية على تفعيل المسار.
تكامل سير العمل والمسارات
يربط مقايسة ربط التقارب في الموقع (in situ proximity ligation assay) هذه بين مرحلة الاكتشاف المبكر والأبحاث قبل السريرية من خلال تمكين القياس الكمي القوي للتفاعلات بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا (ER-mitochondria interactions) في الخلايا والأنسجة المثبتة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات الخاصة بآليات التواصل بين العضيات.
- المسح: توفر قراءات كمية وقابلة للتكرار لحملات مسح المركبات أو المسح الجيني.
- التحليلات: تتيح الكشف الحساس عن تقارب البروتينات بأقل من 40 nm، مما يسمح بالمقارنة الإحصائية لترددات التفاعل.
- الأبحاث الانتقالية: تسهل مواءمة المؤشرات الحيوية والتحقق الميكانيكي في العينات ذات الصلة بالأمراض.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: توفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسات تفاعل البروتينات المتنوعة عبر برامج البحث والتطوير المتعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد عملية الكشف عن تفاعلات البروتينات الداخلية بحساسية ونوعية عاليتين.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أفضل بشأن المتابعة أو الإيقاف من خلال توفير بيانات ميكانيكية قوية في مرحلة مبكرة من مسار العمل.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالأهداف ذات ملفات تفاعل العضيات التي تم التحقق من صحتها.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في بروتوكولات التألق المناعي ومقايسة الربط التقاربي.
- تتطلب الوصول إلى أجسام مضادة عالية الجودة وبنية تحتية للتصوير الفلوري.
- تستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان دقة التكميم القابل للتكرار عبر الدراسات.
- قابلة للتكيف مع كل من الخطوط الخلوية وخزعات الأنسجة المدمجة في البارافين لضمان الصلة الترجمية.
- مقتصرة على العينات المثبتة؛ وغير مناسبة لدراسات التفاعلات الديناميكية للخلايا الحية.
