عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

الهدف العام من هذا النهج البروتومي هو توصيف إعادة التنظيم الجزيئي في المشابك العصبية بعد التعلم وتكوين الذاكرة لفهم الآليات الأساسية ومسارات التأشير. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها منهجية خالية من الفرضيات المسبقة، مما يسمح بالتقدير الكمي والتوصيف واسع النطاق لتعديلات ما بعد الترجمة ضمن البروتينات المشبكية. كما يتيح سير العمل المعتمد لدينا إيجاد ارتباط بين تغير جزيئي معين وسلوك محدد.

تعتمد عمليات التعلم وتكوين الذاكرة على تغيرات في الكفاءة التشابكية، ولذلك يجب أن تركز الدراسات البروتومية على تحليل البنى التشابكية مثل السينابتوزومات بدلاً من متجانسات أنسجة الدماغ. تمثل النتائج البروتومية مجموعات بيانات عالية التعقيد، وبالتالي فهي تتطلب معالجة معلوماتية حيوية. ابدأ التدريب بوضع فأر الاختبار في صندوق مكوك خافت الإضاءة داخل غرفة عازلة للصوت.

استخدم جدول تعلم يتم التحكم فيه بالكامل بواسطة الكمبيوتر لتعلم التمييز السمعي. ابدأ بفترة تعود تتكون من ثلاث دقائق من الصمت قبل بدء جلسة التدريب. وخلال تجارب "الانطلاق" (go trials)، يجب على الحيوان عبور الحاجز في غضون ست ثوانٍ من تقديم النغمة لتسجيل إصابة.

خلال تجارب عدم الاستجابة (no-go trials)، يجب أن يبقى الحيوان في الحجرة الحالية من صندوق المكوك خلال الثواني الست من تقديم النغمة. قم بإجراء 30 تجربة استجابة (go trials) و 30 تجربة عدم استجابة بترتيب عشوائي زائف، مع فاصل زمني بين التجارب قدره 20 ثانية، بحيث تتكون الجلسة الواحدة من 60 تجربة وتستغرق حوالي 25 دقيقة. وبمجرد الانتهاء من جميع التجارب، أعد الفأر المدرب إلى القفص الرئيسي حتى وقت التضحية.

بعد التضحية بالفأر وإزالة الدماغ، حدد موقع القشرة السمعية باستخدام المعالم البصرية بما في ذلك الأوعية الدموية وشكل السطح. ثم استخدم المشرط والإبرة لتشريح القشرة السمعية من كلا الجانبين ككتلة نسيجية مستطيلة. وباستخدام التصالب البصري كعلامة إرشادية، قم بتشريح القشرة الجبهية كشريحة دماغية بين Bregma 3.56 و 1.54.

قم بتشريح الجسم المخطط كشريحة دماغية بين Bregma 1.54 و 0.5. ثم قم بإزالة النسيج القشري بعناية. قم بتشريح الحصين عن طريق تثبيت الدماغ باستخدام إبرة عبر المخيخ وفك لفافة القشرة بدءاً من الفص القفوي.

قم بتجميد عينات الدماغ المشرحة صدمياً في النيتروجين السائل. ابدأ عملية تنقية السينابتوسومات عبر نقل أنسجة الدماغ المشرحة إلى أوعية التجانس التي تحتوي على 1 mL من Buffer A المبرد بالثلج. بعد ذلك، قم بتجانس الأنسجة عند 900 RPM باستخدام حوالي 12 ضربة. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 1,000 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، احتفظ بالسوائل الطافية. أعد تجنيس الراسب كما سبق، واجمع السوائل الطافية معاً. قم بدوران السوائل الطافية المجمعة لمدة 20 دقيقة عند 12,000 ×g. أعد تعليق الرواسب في واحد ملليلتر من محلول التجنيس المنظم وقم بالتجنيس بست ضربات عند 900 RPM، يليه الطرد المركزي عند 1,200 ×g لمدة 20 دقيقة.

أثناء عملية الطرد المركزي لإنتاج رواسب P2، قم بتحضير تدرجات سكر السكروز في أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق. ابدأ بوضع 2.5 milliliters من منظم السكروز بتركيز 1.0 molar، ثم استخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة 1.5 milliliters من منظم السكروز بتركيز 1.2 molar كطبقة سفلية. وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي، أضف 0.5 milliliters من منظم السكروز بتركيز 0.32 molar إلى رواسب P2.

بعد ذلك، أعد تجنيس العينات باستخدام ست ضربات. قم بتحميل الأجزاء المجنّسة فوق التدرجات. ضع التدرجات المحملة في دوّار ذو دلاء متأرجحة، ثم قم بتدويرها بسرعة 85,000 ×g لمدة ساعتين في جهاز طرد مركزي فائق.

بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، تخلص من طبقة السكروز العلوية بتركيز 0.32 مولار، بما في ذلك المواد الموجودة عند الواجهة مع منظم السكروز بتركيز 1.0 مولار. اجمع السينابتوسومات (synaptosomes) عند الواجهة بين منظم السكروز بتركيز 1 و1.2 مولار. أضف منظم السكروز بتركيز 0.32 مولار إلى جزء السينابتوسومات بنسبة 1.1.

امزج المكونات بعناية ثم قم بالدوران بسرعة 150,000 ×g لمدة ساعة واحدة. تكون التشابكات العصبية (Synaptosomes) موجودة في الراسب، ويمكن إعادة تعليقها في محلول منظم لمزيد من المعالجة. قم بإذابة التشابكات العصبية لكل منطقة من مناطق الدماغ للحيوان في 20 إلى 50 µL من اليوريا بتركيز 8 M عن طريق التحضين على الثلج لمدة ساعة واحدة في حمام موجات فوق صوتية.

خفف المحلول باستخدام منظف قابل للإزالة بتركيز 1% لضمان الوصول إلى تركيز نهائي من اليوريا يبلغ 2 M. بعد تحديد كميات البروتين النسبية باستخدام تقنية SDS-PAGE، انقل ثلث المتبقي من كل عينة باستخدام الماصة إلى أنبوب جديد. قم بإجراء عملية الهضم في المحلول عن طريق إضافة 2 mM من DTT و 25 mM من بيكربونات الأمونيوم، ثم قم برج العينة بلطف باستخدام جهاز الفورتيكس.

قم باختزال العينات لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. أضف 10 millimolar من iota acedomide لإجراء عملية carbamidomethylate لبقايا cysteine ثم اخلط المزيج. حضن العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة 20 درجة مئوية.

وأخيراً، أضف 1 µL من محلول التربسين المخزن (trypsin stock solution) واتركه في الحاضنة عند 20 °C لمدة 12 ساعة. ولإزالة المنظف القابل للتحلل الحمضي، أضف حمض ثلاثي فلوروأسيتيك (trifluoroacetic acid) ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1% واتركه في الحاضنة لمدة ساعة إضافية عند 20 °C. بعد إجراء عملية الطرد المركزي للعينات عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق، اجمع السوائل الطافية بعناية.

ضع عمود الاستخلاص بالطور الصلب في حامل، وقم بموازنة المصفوفة باستخدام 2 mL من الميثانول. بعد الغسيل، أضف 2 mL إضافية من Buffer B ثم قم بتحميل العينة. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام Buffer B، استخلص الببتيدات عن طريق إضافة 200 µL من 70% أسيتونيتريل و 0.1% حمض ثلاثي فلوروأسيتيك.

بعد ذلك، يتم تجفيف العينات المنقاة في جهاز طرد مركزي تفريغي. في هذا المثال، تظهر الحيوانات المدربة على مهمة تمييز نغمة FM معدلاً متزايداً من الإصابات ومعدلاً متناقصاً من الإنذارات الكاذبة على مدار جلسات التدريب. ويحدث تمييز ملحوظ بدءاً من الجلسة الرابعة.

تتم مقارنة الوفرة التشابكية النسبية لبروتينات مختارة بين الفئران التي تدربت على مهمة تمييز نغمة FM والفئران الضابطة الساذجة بعد 24 ساعة من جلسة التدريب الأولى. بعد التدريب، تتغير مستويات بروتين CYFP2 في جميع المناطق المدروسة. لا تنسَ أن الحيوانات غالباً ما تظهر تباينات داخل الفرد الواحد.

لذلك، يُوصى بشدة بتضمين خمس مكررات بيولوجية على الأقل أو أكثر من مجموعات حيوانية متطابقة جيداً في الدراسة. وبمجرد تأسيس هذه التقنية، يمكن تكييفها بسهولة لتطبيقها على أنواع أخرى؛ فعلى سبيل المثال، استُخدمت لمراقبة التغيرات في تعبير البروتين المعتمدة على التعلم في أدمغة مفردة من ذبابة الفاكهة.