عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

الهدف العام لهذا النهج البروتيني هو توصيف إعادة التنظيم الجزيئي في نقاط الاشتباك العصبي بعد التعلم وتكوين الذاكرة لفهم الآليات الأساسية ومسارات الإشارات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي نهج خال من الفرضيات ، مما يسمح بالقياس الكمي وتوصيف ما بعد الترجمة والتعديلات على نطاق واسع داخل البروتينات المتشابكة. يسمح سير العمل الراسخ لدينا بوجود علاقة بين تغيير جزيئي معين وسلوك معين.

يعتمد التعلم وتكوين الذاكرة على تغييرات الفعالية المشبكية ، وبالتالي يجب أن تركز الدراسات البروتينية أكثر على تحليل الهياكل المشبكية مثل الجسيمات المشابكة أكثر من التركيز على المتجانسات من أنسجة المخ. تمثل النتائج البروتينية مجموعات بيانات معقدة للغاية وبالتالي تتطلب معالجة المعلومات الحيوية. ابدأ التدريب عن طريق وضع ماوس الاختبار في صندوق مكوك مضاء بشكل خافت داخل غرفة عازلة للصوت.

استخدم جدولا تعليميا يتم التحكم فيه بالكامل بواسطة الكمبيوتر لتعلم التمييز السمعي. ابدأ بفترة التعود لمدة ثلاث دقائق من الصمت قبل بدء الجلسة التدريبية. أثناء تجارب الذهاب ، يتعين على عبور العقبة في غضون ست ثوان من عرض النغمة لتسجيل ضربة.

أثناء التجارب المحظورة ، يجب أن يظل في المقصورة الحالية لصندوق المكوك خلال ست ثوان من عرض النغمة. قم بإجراء 30 تجربة الذهاب و 30 تجربة محظورة بترتيب عشوائي زائف ، مع فاصل زمني بين المحاكمات يبلغ 20 ثانية بحيث تتكون الجلسة الواحدة من 60 تجربة وتستمر حوالي 25 دقيقة. بمجرد إجراء جميع التجارب ، أعد الفأر المدرب إلى قفص المنزل حتى التضحية.

بعد التضحية بالفأر وإزالة الدماغ ، قم بتحديد موقع القشرة السمعية باستخدام المعالم المرئية بما في ذلك الأوعية الدموية وشكل السطح. ثم استخدم مشرطا وإبرة لتشريح القشرة السمعية بشكل ثنائي ككتلة نسيجية مستطيلة. باستخدام chiasma opticum كمعلم بارز ، قم بتشريح القشرة الأمامية كشريحة دماغية بين Bregma 3.56 و 1.54.

قم بتشريح المخطط كشريحة دماغية بين بريجما 1.54 و 0.5. وإزالة الأنسجة القشرية بعناية. قم بتشريح الحصين عن طريق تثبيت الدماغ بالإبرة عبر المخيخ وفك القشرة بدءا من الفص القذالي.

تجميد الصدمة عينات الدماغ في النيتروجين السائل. ابدأ تنقية المشبك عن طريق نقل أنسجة المخ المقطعة إلى أوعية التجانس التي تحتوي على مليلتر واحد من العازلة المثلجة الباردة أ. ثم قم بتجانس الأنسجة عند 900 دورة في الدقيقة باستخدام حوالي 12 ضربة. الطرد المركزي للعينات عند 1 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، احتفظ بالمواد الطافية. أعد تجانس الحبيبات كما كان من قبل, واجمع المواد الطافية قم بتدوير المواد الطافية المدمجة لمدة 20 دقيقة عند 12 ، 000 مرة G.أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتجانس وتجانسها بست ضربات عند 900 دورة في الدقيقة متبوعة بالطرد المركزي عند 1 ، 200 مرة G لمدة 20 دقيقة.

أثناء الطرد المركزي لإنتاج كريات P2 ، قم بإعداد تدرجات خطوة السكروز في أنابيب الطرد المركزي الفائق. ابدأ ب 2.5 مل من السكروز 1.0 مولار ثم استخدم ماصة باستور الزجاجية للطبقة الفرعية 1.5 مل من السكروز المؤقتة 1.2 مولار. بعد الطرد المركزي ، أضف 0.5 مل من 0.32 محلول سكروز مولار إلى حبيبات P2.

ثم أعد التجانس باستخدام ست ضربات. قم بتحميل الكسور المتجانسة أعلى التدرجات. ضع التدرجات المحملة في دوار دلو متأرجح ثم قم بالدوران عند 85،000 مرة G لمدة ساعتين في جهاز طرد مركزي فائق.

بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، تخلص من طبقة السكروز المولية العلوية 0.32 ، بما في ذلك المادة الموجودة في الواجهة إلى المخزن المؤقت للسكروز 1.0 مولار. اجمع الجسيمات العصبية في واجهة عازلة السكروز من واحد إلى 1.2 مولار. أضف 0.32 المخزن المؤقت من السكروز المولي إلى الكسر المشبكي بنسبة 1.1.

تخلط بعناية وتدور في 150،000 مرة جم لمدة ساعة واحدة. توجد المشبك في الحبيبات ، ويمكن إعادة تعليقها في مخزن مؤقت لمزيد من المعالجة. قم بإذابة المشابك العصبية لكل منطقة من مناطق دماغ في 20 إلى 50 ميكرولترا من 8 مولر من اليوريا عن طريق الحضانة على الثلج لمدة ساعة واحدة في حمام بالموجات فوق الصوتية.

خفف بواحد بالمائة من المنظف القابل للإزالة لضمان التركيز النهائي لاثنين من اليوريا المولية. بعد تحديد كميات البروتين النسبية باستخدام ماصة SDS-PAGE ، ضع ثلث ما تبقى من كل عينة في أنبوب جديد. قم بإجراء الهضم داخل المحلول عن طريق إضافة اثنين من ملي مولار DTT و 25 مللي مولار بيكربونات الأمونيوم ودوامة العينة برفق.

قلل العينات لمدة 45 دقيقة عند 20 درجة مئوية. أضف 10 مللي مولار iota acedomide إلى بقايا carbamidomethylate cysteine واخلطها. احتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 20 درجة مئوية.

أخيرا ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون التربسين واحتضنه عند 20 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. لإزالة المنظف القابل للانقسام الحمضي ، أضف حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى تركيز نهائي قدره واحد بالمائة واحتضانه لمدة ساعة أخرى عند 20 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي للعينات عند 16 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق ، اجمع المواد الطافية بعناية.

ضع عمود استخراج الطور الصلب في رف وقم بموازنة المصفوفة بملليلترين من الميثانول. بعد الغسيل ، أضف ملليلترين إضافيين من Buffer B وقم بتحميل العينة. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام Buffer B ، قم بإزالة الببتيدات بإضافة 200 ميكرولتر من 70 في المائة من الأسيتونيتريل و 0.1 في المائة من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك.

ثم جفف العينات المنقاة في جهاز طرد مركزي مفرغ. في هذا المثال ، تظهر المدربة على مهمة تمييز نغمة FM معدلا متزايدا من الضربات ومعدل متناقص من الإنذارات الكاذبة على مدار الدورات التدريبية. يحدث تمييز كبير منذ الدورة الرابعة.

تتم مقارنة الوفرة المشبكية النسبية للبروتينات المختارة بين الفئران المدربة على مهمة تمييز نغمة FM والفئران الساذجة بعد 24 ساعة من الجلسة التدريبية الأولى. بعد التدريب ، يتم تغيير مستويات بروتين CYFP2 في جميع المناطق التي تمت دراستها. لا تنس أن غالبا ما تظهر اختلافات داخل الفرد.

لذلك يوصى بشدة بتضمين ما لا يقل عن خمسة أو أكثر من التكرارات البيولوجية لمجموعات حيوانية متطابقة جيدا في الدراسة. بمجرد إنشائها ، يمكن بسهولة تكييف هذه التقنية مع الأنواع الأخرى. على سبيل المثال ، تم استخدامه لمراقبة تغيرات التعبير البروتيني المعتمد على التعلم في أدمغة ذبابة الفاكهة الواحدة.