في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

تستخدم الجسيمات النانوية بشكل متزايد في الصناعة والطب نظرا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية الفريدة. ومع ذلك ، لا تزال المخاوف المتعلقة بصحة الإنسان المرتبطة بالتعرض للجسيمات النانوية لفترات طويلة قائمة. يمكن قياس هذه المخاطر من خلال دراسة سلوك الجسيمات النانوية داخل الخلايا والاستجابات الأيضية المستحثة للخلايا للجسيمات النانوية.

ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص الطرق التي تسمح بالكشف عن الجسيمات النانوية الداخلية في خلية الأنف وتقديرها الكمي. في حين يمكن استخدام العديد من الأدوات التحليلية ، بما في ذلك الفحص المجهري وقياس الطيف الكتلي ، لتقدير الامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية ، إلا أنها توفر فقط معلومات نوعية على المستوى المجهري. على العكس من ذلك ، يمكن للطرق في الموقع القائمة على التحليل الطيفي الذري أن تقلل من كمية قطع الأثرية التصويرية التي تنشأ عن تحضير العينة ويمكن أن تؤدي إلى مراقبة مباشرة للجسيمات النانوية.

للاستفادة من ذلك ، نقدم نهجا مترابطا يسمح لنا بدراسة الجسيمات النانوية إما في الحالة الأصلية أو سرير المختبر بعلامة الفلورسنت. هنا ، نصف طريقة تعتمد على مزيج من الفحص المجهري الفلوري وتحليل المسبار المجهري النووي. يوفر هذا صورا للكثافة الخلوية ، والتوزيع الخاص للعنصر الكيميائي ، وكمية الجسيمات النانوية لكل خلية.

كعرض توضيحي ، سنقوم بالبحث من الخلايا المعرضة لجزيئات ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية على مدار 24 ساعة باستخدام كل من الفحص المجهري الفلوري وتحليل المسبار المجهري النووي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، هناك حاجة إلى حامل عينة مخصص مصنوع من نظرة خاطفة على البوليمر. يجب أن تكون مناسبة لزراعة الخلايا والملاحظات في المختبر.

قم بتغطية الحامل بورق بولي كربونات بسمك ميكرون. يتم لصق رقائق البولي كربونات على طبق PEEK بطبقة رقيقة من محلول فورمفار. بمجرد تركيبه ، يجب تعقيم حامل العينة.

يمكن تخزين حاملات عينات معقمة متعددة ، واحدة لكل بئر ، في صفيحة معقمة من اثني عشر بئرا حتى تكون هناك حاجة إليها للاستخدام. يتم فحص الخلايا التي تم نقلها باستخدام بلازميدات GFP الصف المصفوفة بواسطة الفحص المجهري الفلوري للتأكد من حدوث التعدي بنجاح ، وأنها تعبر عن البروتين الفلوري. احصد الخلايا مع التربسين ، واحتضانها لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية.

أوقف عمل التربسين عن طريق إضافة وسيط ثقافة جديد. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 1200 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف حجما مناسبا من وسط الثقافة الطازجة.

عد الخلايا وقم بإجراء التخفيف باستخدام وسط ثقافة كامل طازج وحراري للحصول على تعليق خلوي من 500 خلية لكل ميكرولتر. ضع قطرة 40 ميكرولتر في وسط رقائق البولي كربونات. ضع العينة بعناية في حاضنة الخلية لمدة ساعتين.

أضف ملليلترين من وسط الاستزراع الطازج برفق واتركهما لمدة 24 ساعة. تم تصميم الجسيمات النانوية لأكسيد التيتانيوم الفلوري غير المعدل وتصنيعه وتطعيمها باستخدام الفلوروفورات شائعة الاستخدام من أجل اكتشاف الجسيمات النانوية وتتبعها وتوطينها في المختبر. في هذه الخطوة ، كان من المفترض بالفعل إعداد معلق جزيئات نانوية من ثاني أكسيد التيتانيوم في ماء فائق النقاء بتركيز ملليغرام واحد لكل مليلتر.

تفريق الجسيمات النانوية باستخدام نبضات صوتنة مكثفة مدتها دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف الجسيمات النانوية في وسط استزراع مناسب للحصول على تعليق تعريض أربعة ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع. قم بتبديل وسط زراعة الخلايا السابق إلى هذا الوسط الجديد المحتوي على الجسيمات النانوية واخلطه برفق لتحقيق توزيع متجانس للجسيمات النانوية.

قم بإعداد مجموعة من خلايا التحكم بنفس الطريقة دون إضافة جزيئات ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية. احتضان مجموعات الخلايا لمدة 24 ساعة. باستخدام بارافورمالدهايد ، يمكن إصلاح هذه العينات ومعالجتها للتصوير في الموقع والخلية المفردة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

ومع ذلك ، فإن التثبيت الفيزيائي المبرد يحافظ على البنية التحتية للخلية والسلامة الكيميائية الحيوية. يوقف تثبيت التجميد الغاطس النشاط الخلوي بسرعة في غضون أجزاء من الثانية ويتجنب استخدام المركبات التثبيتية. لإصلاح الخلايا بالتبريد ، نقوم بما يلي.

قم بإعداد لوحة نقل الألومنيوم عن طريق تبريدها في النيتروجين السائل. قم بتخزين اللوحة في صندوق مملوء بالنيتروجين السائل ، مع الحفاظ على سطح اللوحة فوق السائل في بخار النيتروجين البارد. برد كمية كافية من 2-ميثيل بوتان إلى 150 درجة مئوية.

قم بإعداد صقر واحد سعة 50 مل مع وسط استزراع واثنين من الصقور بالماء فائق النقاء. تأكد من وجود ورق ماص قريب لتجفيف العينة قبل تجميدها. اشطف الخلايا مرة واحدة في وسط المزرعة ثم مرتين أخريين في ماء معقم فائق النقاء لإزالة الأملاح الزائدة المتبقية في وسط الاستزراع.

جفف العينة بسرعة على الورق الماص. قم بتجميد الخلايا في 2-ميثيل بيوتان المبرد لمدة 30 ثانية وضعها على لوحة نقل الألمنيوم المبردة. من الأهمية بمكان أن يظل الصندوق مغلقا قدر الإمكان لمنع بخار الماء من التكثيف على سطح اللوح البارد.

بعد تجميد جميع العينات ، يتم إجراء التجفيف بالتجميد بالطريقة التالية لتسامي أي ماء. أولا ، قم بإجراء تجفيف أولي لمدة 12 إلى 24 ساعة عند الضغط المنخفض ودرجة الحرارة المنخفضة. بعد ذلك ، مع الحفاظ على الضغط منخفضا ، قم بإجراء مرحلة تجفيف ثانوية لمدة 24 ساعة على الأقل مع زيادة درجة حرارة اللوحة إلى 40 درجة مئوية.

بعد التثبيت بالتبريد ، يمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام في ظروف معقمة وجافة محمية من الغبار والرطوبة. تم إجراء تحليل المسبار الدقيق النووي في منشأة إيفيرا في بوردو ، فرنسا. يوفر مسرع الجسيمات أحادي الجهدين 3.5 ميجافولت شعاعا أيونيا ضوئيا في نطاق طاقة ميجا إلكترون فولت.

تم إجراء تصوير العناصر الكيميائية على خط شعاع المسبار الدقيق باستخدام تقنيات تحليلية تكميلية للحزمة الأيونية. التقنيات المستخدمة من خلال micro-PIXE ، وانبعاث الأشعة السينية الناجم عن الجسيمات ، و STIM ، والفحص المجهري الأيوني لإرسال المسح ، و micro-RBS ، مطياف التشتت الخلفي في رذرفورد. يتم وضع العينات داخل غرفة التحليل وتشعيعها تحت الفراغ بجزيئات مختلفة من أجل إجراء تحليلات مختلفة للحزمة الأيونية.

يستخدم STIM لتسجيل خرائط الكثافة الهوائية للخلايا بناء على جزيئات الطاقة الفضفاضة التي تمر عبر مناطق الخلايا ذات الكثافات المختلفة. يوفر تحليل Micro-PIXE و micro-RBS التوزيع المكاني والقياس الكمي للعناصر الكيميائية على مستوى الخلية الواحدة. يتم تركيز شعاع البروتون المجهري 1.5 ميجا إلكترون فولت إلى قطر يبلغ حوالي 1 ميكرومتر ويتم مسحه ضوئيا عبر الخلايا ذات الأهمية ، والتي تم تحديدها بواسطة STIM.

الأشعة السينية المنبعثة من الذرات الموجودة في العينة ، والتي تتراوح من الصوديوم إلى التيتانيوم ، بتحديد تركيزات العناصر. يتم جمع البروتونات المتناثرة من أجل قياس العدد الإجمالي للجسيمات الواردة المطلوبة لتطبيع شدة الأشعة السينية. من الأهمية بمكان أن يكون لديك معايير معايرة معتمدة لتقدير تركيزات العناصر من أجل معايرة استجابة كاشف الأشعة السينية.

من أجل تحليل بيانات الحزمة الأيونية ، قمنا بتطوير مكون إضافي جديد ل ImageJ. أولا ، تم حساب خرائط كثافة STIM. يرجع التباين في مسح صور الفحص المجهري للحديد إلى الاختلافات المحلية في الكثافة ويسمح باكتشاف هياكل الخلايا مثل النواة والسيتوبلازم.

يمكن معالجة العديد من الخرائط في وقت واحد. تتوافق كل خريطة مع الطاقة المنقولة من الجسيمات الواردة. تتمثل الخطوة الثانية في تحليل البيانات في حساب أطياف الخلايا الفردية.

عن تحليل انبعاث الأشعة السينية الناجم عن الجسيمات كلا من التركيب الكيميائي للعينة والخرائط الأولية للعناصر الكيميائية. يتم حساب خرائط العناصر الكيميائية بعد فرز الفوتونات وفقا لموضع الحزمة في وقت التسجيل واختيار نافذة طاقة تتمحور حول عنصر معين. تمثل الخرائط عادة عدد الأحداث المكتشفة في موضع الحزمة وتحتوي على بيانات كمية.

يتم حساب كومة من الخرائط الكيميائية ، واحدة لكل عنصر محدد. تم العثور على مناطق الأهمية لكل خلية باستخدام بيانات PIXE للفوسفور. ثم يتم حساب الأطياف المقابلة لكل خلية بأكملها عن طريق جمع الأطياف الفردية عبر منطقة اهتمام كل خلية.

من هنا ، يمكن استخراج البيانات الكمية حول الوفرة الكيميائية في كل خلية باستخدام برنامج تحليل PIXE و IBS المخصص. نعرض هنا صور مضان للخلايا بعد تثبيت بارافورمالدهايد. يظهر الصف العلوي الخلايا التي لم تتعرض لجزيئات ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية بينما كان الصف السفلي.

تظهر القناة الزرقاء نواة الخلية ، وتظهر القناة الخضراء الميتوكوندريا ، وتظهر القناة الحمراء التيتانيوم. يمكن ملاحظة أنه لا يوجد ثاني أكسيد التيتانيوم في الضوابط. من القناة المدمجة على اليمين ، يمكن ملاحظة أن الجسيمات النانوية موجودة حصريا في السيتوبلازم ويتم استبعادها من الميتوكوندريا.

ومع ذلك ، فإن ما تفتقر إليه هذه الطريقة هو المعلومات الكمية حول تركيز الجسيمات النانوية. يمكن أن يأمل تحليل المسبار الدقيق النووي في توفير هذا. تم التقاط جميع هذه الصور باستخدام تقنيات تحليل المجهريات المختلفة.

مرة أخرى ، يعرض الصف العلوي خلايا التحكم ويعرض الصف السفلي الخلايا التي تحتوي على جزيئات التيتانيوم النانوية. تظهر الصورة الموجودة في أقصى اليسار قياسات STIM لكثافة الخلايا الثابتة بالتبريد. توضح اللوحات الثلاث التالية وفرة البوتاسيوم والفوسفور والتيتانيوم الموجودة في الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة PIXE.

مرة أخرى ، لا يوجد تيتانيوم مرئي في عناصر التحكم ولا في نوى الخلية. من أجل تحديد امتصاص التيتانيوم ، خلية تلو الأخرى ، نحدد مناطق الاهتمام بناء على حدود الخلية الموضحة في اللوحة الموجودة في أقصى اليمين ونقيس وفرة العناصر في هذه المناطق. من قياسات PIXE هذه ، قمنا برسم توزيع وفرة العناصر على مستوى الخلية المفردة للتحكم والمجموعات المكشوفة.

يتم رسم السكان الضابطين باللون الأبيض ، ويتم رسم السكان المعرضين باللون الأصفر. متوسط محتوى التيتانيوم الموجود هنا منخفض جدا مقارنة بجرعة التعرض البالغة أربعة ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع. يظهر نطاق امتصاص التيتانيوم تباينا كبيرا بين السكان ، من 0.2 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع إلى 1.8 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع.

لاحظنا أيضا زيادة في الأيونات الحرة داخل الخلايا مثل البوتاسيوم والكالسيوم في العينات المعرضة للجسيمات النانوية ، مما يشير إلى تغيير في التوازن الخلوي الناجم عن وجود جزيئات ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية. يمكن أن يوفر تحليل المسبار الدقيق النووي معلومات مفيدة عن المستوى تحت الخلوي ويوفر تقديرا كميا للعناصر الكيميائية التي تشكل عينة بيولوجية. تقدم هذه التقنيات العديد من المزايا.

واحد ، في تحضير العينة التي لا تتطلب تثبيتا كيميائيا. ثانيا ، إمكانية دراسة مناطق أكبر مع القدرة على التركيز على مناطق إضافية ذات أهمية. ثالثا ، القياس الكمي للعناصر الكيميائية بحساسية بضعة ميكروغرامات لكل جرام.

ورابعا ، تحديد حجرات الخلايا مثل النواة والنواة والسيتوبلازم. يعد التحديد الدقيق لتلك ، عند دراسة استيعاب الجسيمات النانوية في الخلايا المفردة ، أمرا ضروريا لعلم السموم الكمي للجسيمات النانوية. كما هو موضح في الحالات التي تمت دراستها هنا ، فإن القدرة على مراقبة الجسيمات النانوية وتحديدها داخل الخلايا الفردية تسمح لنا بفهم أفضل لتراكم قيمة العناصر الكيميائية الداخلية والخارجية ، مثل الجسيمات النانوية لأكسيد المعدن.

يسلط هذا البروتوكول الضوء على مدى ملاءمة تحليل المسبار الدقيق النووي للدراسات المستقبلية لتفاعل الجسيمات النانوية مع الخلايا الحية. يعطي النهج الكمي معلومات حول تأثير هذه الجسيمات النانوية من حيث الكشف وتحديد الموقع والقياس الكمي ، وعلى مستوى الخلية المفردة لكل من الجسيمات النانوية الأصلية والكيميائية المعدلة.