نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو التحقيق في التأثيرات الحيوية الناجمة عن التجويف في الحبس الموائع الدقيقة باستخدام الزخرفة السطحية للتحكم بدقة في توليد الفقاعات الترادفية وموقع وشكل الخلايا المستهدفة الفردية. يتيح هذا النظام الموائع الدقيقة تجربة فقاعات وخلايا التجويف العابرة ذات الصلة بالنشر العلاجي والسليم والتشغيل الصوتي. تأتي الميزة الرئيسية لهذه التقنية من تحسين الدقة من الزخرفة السطحية.

يسمح لنا بدراسة التأثيرات الحيوية للخلايا الفردية وهو تحميل تيار عال من تفاعل الفقاعات الفقاعية الموثوق به. يعد العرض المرئي للإجراءات أمرا بالغ الأهمية لأن الزخرفة السطحية وإعداد الخلايا في خطوات الرقاقة معقدة تتضمن تقنيات ونصائح مختلفة. قم بتنفيذ جميع إجراءات التصنيع الدقيق في غرفة نظيفة أثناء ارتداء بدلة غرفة نظيفة.

صمم مساحة كل نقطة ذهبية في حدود 25 إلى 30 ميكرون مربع، بحيث تكون كبيرة بما يكفي لامتصاص طاقة الليزر لتوليد الفقاعة، ولكنها صغيرة بما يكفي لتجنب التصاق الخلايا الفردية بها. قم بتنظيف الشريحة الزجاجية في غطاء كيميائي وفقا لبروتوكول النص ، ثم انتقل إلى غطاء الطلاء بالدوران. قم ببرمجة مبرمج الدوران للتسارع إلى 1000 دورة في الدقيقة خلال ثانيتين والحفاظ على هذه السرعة لمدة خمس ثوان ثم اجعله يرفع إلى 3000 دورة في الدقيقة على مدى ثلاث ثوان وحافظ على هذه السرعة لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، قم بتأمين الشريحة الزجاجية في مبرمج الدوران باستخدام المكنسة الكهربائية. ثم قم بتغطية الشريحة ب P20 وابدأ دورة الدوران. بعد ذلك ، قم بتطبيق مقاومة الصورة السلبية NFR باستخدام نفس الدورة.

الآن ، اخبز الشريحة على طبق ساخن عند 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. بمجرد أن تبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإجراء الطباعة الحجرية الضوئية. قم بتركيب قناع الكروم على تقويم القناع وتأكد من أن جانب النمط متجها لأسفل باتجاه الشريحة.

بعد ذلك ، اضبط وصفة الطباعة الحجرية الضوئية على وضع التعرض الصلب مع تسع ثوان من التعرض للأشعة فوق البنفسجية وقم بمحاذاة الركيزة الزجاجية مع القناع. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، اخبز الشريحة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم اتركها تبرد كما كان من قبل. لتطوير النمط على الشريحة ، ضعه في محلول المطور لمدة 60 ثانية ، ثم اغسل الشريحة بالماء المقطر وجففها بغاز النيتروجين.

بعد تأكيد النمط عن طريق الفحص المجهري ، اخبز الشريحة على حرارة 120 درجة مئوية لمدة خمس دقائق واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. الآن ، قم بتنظيف الشريحة بالبلازما في آلة النقش الأيوني التفاعلية لمدة 90 ثانية عند 500 تور و 100 واط. باستخدام مبخر شعاع إلكتروني ، قم بلصق العينة على حامل اللوحة.

قم ببرمجة الجهاز لإيداع طبقة 5 نانومتر من التيتانيوم ، متبوعة بطبقة 15 نانومتر من الذهب. بمجرد اكتمال هذا الوضع ، قم بتهوية الجهاز. بعد ذلك ، انقع الشريحة طوال الليل في دورق من مذيب مزيل الضوء لإزالة الذهب الموجود فوق مقاومة NFR.

في اليوم التالي ، اغسل الشريحة بالأسيتون ، متبوعا ب IPA ثم جففها بالنيتروجين. اشطف الشريحة بماء DI وجففها مرة أخرى بالنيتروجين. الآن ، قم بتسخين الشريحة على 115 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتنظيف شريحة نمط النقطة الذهبية باستخدام أشر بلازما الأكسجين عند 100 واط لمدة 90 ثانية. اضبط مساحة كل جزيرة مشفرة بالفبرونيكتين لتكون في حدود 700 إلى 900 ميكرون مربع لتسهيل انتشار خلايا هيلا الكافية في منطقة مربعة مع تقليل فرص تراكم خلايا متعددة في الجزيرة. التصنيع يشبه إلى حد كبير نمط الذهب.

قم بتدوير الشريحة كما كان من قبل باستخدام S18 المقاوم للضوء الإيجابي واخبزها على الترميز عند 115 درجة مئوية. ثم قم بإجراء الطباعة الحجرية الضوئية ، ومحاذاة العلامات الموجودة على القناع مع تلك الموجودة على الركيزة. تحقق من النمط الموجود على الجزء المركزي لتأكيد الزاوية الصحيحة واضبط مسافة المواجهة من النقاط الذهبية إلى النمط H.

قم بتشغيل التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة تسع ثوان دون أي خبز لاحق. الاختلاف التالي هو أن خطوة التطوير تستغرق 45 ثانية فقط. بالنسبة للنقش الأيوني التفاعلي ، اضبط المقاييس على 500 تور 100 واط و 90 ثانية.

بعد ذلك ، ضع قطرة من محلول تخميل ربط PLLG على قطعة من فيلم البارافين وقم بشطيرة المحلول على جانب نمط الشريحة. تجنب محاصرة الفقاعات. بعد 45 دقيقة ، قم بإزالة الشريحة من الفيلم.

اشطف الشريحة بماء DI ثم جففها بالنيتروجين. بعد ذلك ، انقع الشريحة على التوالي في مزيل مقاوم للضوء 1165. ثم 50 بالمائة 1165 في ماء DI.

ثم فقط ماء DI. خلال كل حمام ، حرك المحلول في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 90 ثانية. الآن ، جفف الشريحة على طبق ساخن ، ثم أغلقها في مجفف وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية.

قم بتجميع الشرائح في شريحة قناة دقيقة كما هو موضح في بروتوكول النص. انتبه جيدا لحماية المنطقة المزخرفة من الركيزة الزجاجية باستخدام لوح PDMS الصغير قبل استخدام النقش الأيوني التفاعلي لإزالة ربط PLLG من المنطقة الطرفية. استرجع الزجاج المزخرف من آلة RIE وقم بإزالة لوح PDMS الصغير.

بعد معالجة PDMS للقناة الدقيقة بجرعة مخفضة من بلازما الأكسجين ، قم بمحاذاة الركيزة الزجاجية المزخرفة تحت مجسم قم بإحضار PDMS للقناة الصغيرة والركيزة الزجاجية المزخرفة في اتصال مطابق. الآن ، تابع استخدام الشريحة.

أولا ، قم بتجهيز الشريحة عن طريق تدفق PBS أسفل القناة الدقيقة لمدة 30 دقيقة بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة. ثم قم بنقع الرقاقة بمحلول الفبرونيكتين لمدة 45 دقيقة بنفس معدل التدفق. أثناء الانتظار ، قم بإعداد الخلايا بخمسة ملايين خلية لكل ملليلتر.

تعد الحالة الصحية والالتقاء العالي أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء. في وقت لاحق ، استبدل المحلول المتدفق عبر الرقاقة ب PBS وقم بزيادة معدل التدفق إلى عشرة ميكرولتر في الدقيقة. دع PBS يتدفق لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بحقن الخلايا المحضرة في الشريحة باستخدام حقنة. عندما تتدفق قطرة واحدة من الأنبوب ، أوقف الحقن وقم بتثبيت المخرج. ثم ضع الشريحة في حاضنة لمدة 30 دقيقة.

في وقت لاحق ، حرر المخرج واغسل الرقاقة بوسط زراعة الخلايا بسرعة عشرة ميكرولتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بإسقاط التدفق إلى 0.75 ميكرولتر في الدقيقة وانقل الشريحة والمضخة إلى حاضنة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، تابع توليد الفقاعات الترادفية لمشاهدة الشريحة تحت مجهر مقلوب مع ليزرين NDI نابضين على عناصر التحكم في التوقيت الموجهة إلى نمط النقطة الذهبية وبكاميرا عالية السرعة جاهزة لالتقاط النتائج.

بالنسبة لفقاعات 50 ميكرون ، اضبط التأخير بين الليزرين على 2.5 ميكروثانية واضبط قوتهما على عشرة ميكروجول. بعد ذلك ، قم بمزامنة تسجيل الكاميرا عالية السرعة مع الليزر وقم بعمل سجلات بمعدل مليوني إطار في الثانية مع تعريض ضوئي 200 نانو ثانية. وبالتالي ، يتم تسجيل ديناميكيات توسع الفقاعة ، وتفاعل الفقاعة بين الفقاعة الانهيارية ، وتكوين النفاثة.

تمت دراسة تفاعلات الفقاعات الفقاعية ومجموعة متنوعة من التأثيرات الحيوية الناجمة عن التجويف على مستوى الخلية المفردة باستخدام التقنية الموصوفة ، مثل التفاعلات العابرة للفقاعات الترادفية مع التكوين النفاث ، وتصور مجال التدفق الناتج وحساب سرعة النفاثة. يبلغ تدفق النفث الاتجاهي حول الفقاعة الترادفية حوالي عشرة أمتار في الثانية ، ويبلغ عرضه حوالي عشرة ميكرونات ، وبالتالي فهو قادر على إنتاج تدرج إجهاد وإجهاد محض مندفع وموضعي على الخلايا المستهدفة القريبة. كما تمت دراسة تشوه غشاء الخلية الناجم عن الفقاعة الترادفية.

يتم تسليط الضوء على تشوه الغشاء واستعادته من خلال إزاحة الخرز الوظيفي المتصل بالحافة الأمامية لغشاء الخلية. من إحداثيات ثالوث من الخرز المجاور ، تم حساب سلالة المنطقة المحلية. يوضح هذا التخطيطي الحد الأقصى لتغيير المساحة في مواقع مختلفة على سطح الخلية.

يتم شد الحافة الأمامية بشكل أساسي ، بينما يتم ضغط الحافة الخلفية أو الجوانب الجانبية للخلية مما يشير إلى عدم التجانس وتشوه الخلية الناتج عن تدفق النفث الناجم عن الفقاعة الترادفية. يتكون التباين الزمني لسلالة المنطقة عند الحافة الأمامية للخلية من عدد قليل من التذبذبات السريعة متبوعة بامتداد كبير ومستدام لمدة 100 ميكروثانية تقريبا ، وانتعاش تدريجي لاحق على مقياس زمني يبلغ عدة أجزاء من الثانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تفاعل فقاعة فقاعة يمكن التحكم فيه لدراسة التأثيرات الحيوية للخلايا المفردة ذات الشكل والموقع المتحكم فيه من الزخرفة السطحية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء المزيد من التدابير مثل ترقق الهيكل الخلوي والتصوير الزوجي لدراسة إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للخلية لعلاج الفقاعات الترادفية. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الموجات فوق الصوتية تحت البريتيك لاستكشاف التأثيرات الحيوية الناجمة عن الوسر على مستوى الخلية الواحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على التقاء خلوي جيد وحالة للنجاح أثناء زخرفة الخلية.

لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية والليزر في الغرفة النظيفة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ونظارات الليزر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.